一种克隆无动物成分的人胚胎干细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种将人体细胞核与人卵母细胞核置换克隆胚胎干细胞技术，包含以下主要步骤：采集制备人供体细胞；促排卵，取卵；脱卵母细胞周围的卵丘细胞；人卵母细胞核与人体细胞核置换；核置换后的人卵母细胞激活和体外培养发育到囊胚技术。本发明专利技术是克隆与人供体基因相同的胚胎干细胞技术，同时也是克隆人的关键技术。克隆的胚胎干细胞无任何动物成分，经过体外培养可建立胚胎干细胞系，定向诱导分化为人体各种干细胞，为应用干细胞治疗、克隆组织和器官等临床治疗性研究奠定基础，同时控制克隆人技术的发展。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
一
技术介绍
状况第一个未分化的小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ES细胞)系是1981年，英国剑桥大学的Evans和Kaufman将延迟附植的胚胎进行培养，从4-6天的囊胚内细胞团分离而得。1994年，Wheeler和Robert等分离获得了猪的ES细胞。直到1998年美国威斯康星大学Thomson和以色列Rambam医学中心ItskovitxEldor等从人体外受精囊胚中分离到了ES细胞。同年约翰霍普金斯大学的Shamblott等从人原始生殖细胞中分离获得人的全能性干细胞。1997年英国科学家应用核移植克隆胚胎技术，培育出了世界上第一只体细胞克隆绵羊-多利。此技术的成功极大的促进了克隆人胚胎干细胞研究。ES细胞具有全能性，且增殖能力强、分化潜力巨大，可在体内外定向诱导分化为各种细胞、组织和器官，用于替代、修复病损的细胞、组织和器官。治疗目前不能治疗的许多疾病。近期的美国《科学》杂志上列出了2002年值得关注的六大热门科技领域，干细胞研究位于首位，未来抢占生命科学制高点的将会是干细胞组织工程技术。自上世纪90年代以来，科学家开展ES细胞分离与定向培养方面的研究发现不论是来自于动物或人类的ES细胞，在体外都能定向分化为各种细胞，如内皮细胞、血液细胞、神经细胞、软骨细胞、肌肉细胞、肝脏和胰岛细胞等。ES细胞可在体内外诱导分化为机体所有的组织和器官需要的干细胞。干细胞功能新概念的形成和新技术的产生和发展，将为血液病、心血管病、恶性肿瘤、神经系统疾病、糖尿病以及其它需要组织修复和干细胞移植治疗的疾病带来新的治疗希望。可是由于ES细胞来源困难及在体外分化诱导中不易控制，因而影响了采用ES细胞作为细胞和组织修复治疗的前景。细胞、组织、器官移植性治疗是个性治疗的原则，异种、同种异体干细胞用于临床会引起免疫排斥反应。其主要原因是组织相容性复合体(MHC)不同。因此干细胞的来源与数量是细胞治疗最关键的问题，干细胞组织工程技术的发展和完善，将使人们能用上自己基因的干细胞或干细胞衍生的新组织器官，来替代病变或衰老的组织和器官，治疗目前不能治疗的多种疾病。所以，目前开发一种能提供相同组织特异性的人胚胎干细胞的技术势在必行。为此克隆人自体基因的ES细胞诱导定向目的干细胞分化移植治疗，或克隆人组织、器官工程是解决细胞、组织移植治疗的根本，是21世纪国际研究焦点。目前国际上有牛、兔、绵羊类ES细胞系培养成功的报道。韩国报道采用牛卵作为人体细胞核转移的受体细胞，可以得到人胚胎干细胞。我国的中山医科大学陈系古教授等先后使用“核移植”技术将人类皮肤细胞核移植到家兔卵母细胞中，经过2000多次试验，成功克隆出100多个人类胚胎，其中部分发育到“桑椹胚”阶段。采用牛卵和兔卵作为受体细胞克隆人ES细胞，虽然存在卵细胞来源相对丰富，易于获取等优点。但用动物细胞作为受体细胞克隆的人胚胎干细胞含有动物成份，用于人类疾病的治疗有一定危险。本专利技术建立了一种用人体细胞，经与人卵母细胞的核置换构建自体基因的人胚胎干细胞克隆技术。该方法首先建立人体细胞系，将体细胞核移植到去核的人卵母细胞中，在体外将胚胎细胞培养发育至囊胚。这些胚胎干细胞及其衍生的细胞和组织进行自体移植，移植后不会产生免疫排斥反应。该专利技术有助于患者病变组织及其功能的重建，对人类治疗性克隆研究的贡献将是巨大的。二、申请专利技术1、建立克隆人关键技术平台。2、构建人自体基因的胚胎干细胞克隆技术平台。三、建立该技术的目的和意义1、提供构建与人个体基因型相同的人胚胎干细胞方法，为细胞及基因治疗提供“材料”来源。人胚胎干细胞具有全能性，且增殖能力强、分化潜力巨大，可在体内外定向诱导分化为各种细胞、组织和器官，用于替代、修复病损的细胞、组织和器官。可以说该技术是一座金桥，只有通过它，其他技术才可以通向理想完善的彼岸。该技术为以下临床治疗性研究奠定了坚实基础第一人胚胎干细胞在体外定向诱导分化为所需的特定干细胞后，直接用于临床移植治疗皮肤病、神经系统疾病、血液病等多种疾病。第二用干细胞携带治疗基因，经过诱导分化为成体细胞，用于治疗遗传性疾病。第三利用干细胞的跨系统分化潜能，用于自体组织和器官的修复，可以避免同种异体移植的免疫排斥反应。第四建立经遗传改构的通用型MHC基因型胚胎干细胞系或度身定做一个与受者MHC同型的ES细胞系。以供患者任意选用。第五ES细胞可作为基因打靶的靶细胞，借助基因打靶技术，可定点整和外源基因，对与人类疾病相关的基因进行遗传改造，寻找治愈疾病的新途径。第六建立包含多种MHC基因型的胚胎干细胞库，以满足不同患者的需求。第七将干细胞作为种子细胞，与可降解支架材料联合培养，在体外构建有生命的种植体，修复组织缺损或再生组织和器官。第八建立干细胞库，用于将来自体病损或衰老组织器官的修复，也可经配型后，用于同种异体组织或器官的修复等。2、构建人胚胎干细胞为克隆人的关键技术平台。通过以下方法可获得克隆人(1)获得所需克隆者的体细胞，将其作为供体核的来源；(2)获得志愿捐献者的卵母细胞；(3)去掉卵母细胞的核；(4)通过显微注射的方式将供体细胞核转移至去核卵母细胞中；(5)经电融合、激活融合细胞；(6)体外培养融合细胞至桑葚胚(7)将4胚胎细胞、桑葚胚或囊胚移植到志愿者体内，使之发育成胎儿(伦理、法律允许方可进行)。根据上述，可以明显看到本专利技术的最大优势在于采用此技术可提供自体基因的人胚胎干细胞，为克隆人组织和器官无排斥反应移植治疗技术奠定基础。为科研和临床治疗性研究提供充足的材料。在体外ES细胞可定向诱导分化为人体所需要的全新的、无免疫异原性的细胞、组织和器官，用来取代病变的细胞、组织、器官，可避免移植排斥反应的发生，治疗目前不能治疗的许多疾病，展现出广阔的临床应用前景。四、方法步骤克隆人胚胎干细胞技术主要包含以下步骤1、制备人供体细胞，建立细胞系。用于核移植的体细胞可获自供体各种细胞和组织，制备的供体体细胞系包括人皮肤细胞、成纤维细胞和外周血淋巴细胞、等。体细胞系是指将体细胞培养传代后应用。外周血淋巴细胞是理想的细胞类型，细胞易于分离获得。从外周血分离出的单个核细胞可直接用作供体细胞，也可在体外培养24小时后，用作供体细胞体细胞系的传代培养通过胰蛋白酶处理后，用含10％-15％人脐血血清(AB型)和100U/L青霉素-100μg/L链霉素的RPMI1640细胞培养液，在37℃、5％CO2环境下培养。如供体细胞为淋巴细胞，则按以下步骤制备供体细胞。抽取供者外周静脉血5ml，每毫升血用肝素(500U/ml)30μl抗凝，在抗凝血中加入等量生理盐水充分混匀，然后用尖吸管沿管壁徐徐加入等量淋巴细胞分层液(比重为1.077)，离心2000rpm/min，20min，用尖吸管吸取淋巴细胞层，置于Hank’s液的试管中，混匀后，1000-1500rpm/min，离心10min，弃上清，将细胞悬浮于2ml Hank’s液中再洗涤2次。用含15％人脐血血清的RPMI1640细胞培养液，在37℃，5％CO2条件下培养24小时，作为核供体的来源。以表皮细胞作为供体细胞时，取供者皮肤小块先放置于0.02％EDTA中在室温条件下作用5分钟；然后置入0.25％胰蛋白酶中冷消化(4℃)过夜本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种克隆无动物成分的人自体基因胚胎干细胞的方法，该方法包括以下步骤：ａ、制备人供体细胞；ｂ、采集卵母细胞培养；ｃ、去掉卵母细胞周围的卵丘细胞，穿刺卵母细胞透明带以得到裂口，从该裂口处去掉极性小体和周围的胞质，得到去核的卵母细胞；ｄ、将供体细胞核移入去核的卵母细胞内；ｅ、融合细胞经过激活后体外培养发育成桑椹胚、囊胚；ｆ、将囊胚细胞消化获得单个胚胎干细胞，建立胚胎干细胞系，其特征是所述的卵母细胞是通过对志愿者促排卵，采集人卵母细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李建远，王海燕，刘运祥，刘雪霞，靳韶华，
申请(专利权)人：李建远，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]