富含具有羧基末端脯氨酸残基的肽的蛋白质水解产物制造技术

本发明专利技术提供了一种分离的具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性的多肽，该多肽选自：（ａ）一种其氨基酸序列与ＳＥＱＩＤＮＯ：２的氨基酸１～５２６具有至少４０％的氨基酸序列一致性的多肽，或其片段；（ｂ）一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格性条件下与（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１的核酸序列或其片段杂交，该核酸序列或片段与其在６０个，优选地为１００个核苷酸上具有至少８０％或９０％的一致性，更优选地为在２００个核苷酸上具有至少９０％的一致性，或与（ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１的核酸序列的互补核酸序列杂交。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质水解产物、生产水解产物的方法和这些水解产物的用途。
技术介绍
牛奶或牛奶组分的酶水解产物在食品工业上仅有有限的应用。然而，这些水解产物在市场中占有引人关注的位置，如由大量对获得这样的水解产物的最优化的方法进行描述和要求保护的文献所证实的。将牛奶或牛奶组分用具有蛋白水解活性的酶处理以生产水解产物，这主要是为了使产物的变应原性最小化、通过提供一种易于可同化的消化而促进胃肠摄取以及在酸性产品中稳定蛋白质以防止其在延长的贮存期间沉淀。尽管减少牛奶蛋白质的分子量是通常可接受的产生这些有益作用的操作，但对牛奶蛋白质的酶促水解确实具有缺点。将牛奶与酶温育的消极方面包括不完全的蛋白水解消化、减小肽片段的长度后愈加苦的味道、由于必不可少的纯化步骤而导致终产物的减少的产量以及由高水平的游离氨基酸所导致的讨厌的味道变化。通过与内切蛋白酶温育，所有牛奶组分的一致的和完全的降解通常是很难得到的。例如，已知β乳球蛋白是蛋白酶抗性的且对该分子的部分消化可导致对婴儿配方(infant formulae)未预料到的强免疫原性反应，以及在产品如酸性运动饮料中可见的蛋白质沉淀。为了保证在蛋白质水解产物中不存在不充分消化的蛋白质，通常需要一个最终的超滤步骤以从水解产物中去除任何残存的大肽片段。从水解产物中去除这些部分消化的蛋白质片段的不可缺少的步骤必然降低了最终消化产物的产量，从而增加了生产成本。蛋白质抗原性可通过将蛋白质降解为仅具有8-10个氨基酸残基的肽而克服，但通过这样高强度酶促消化而造成的肽是非常苦的。对这种现象的一般解释为具有高的疏水氨基酸含量的小肽促进了苦味。所用蛋白质原料的特性、用于消化的蛋白水解酶的类型和所得肽的长度在很大程度上决定了最终水解产物的苦味程度。例如，已知含有许多疏水氨基酸的酪蛋白可比乳清蛋白生成更多的苦味水解产物。在工业操作中，蛋白质水解产物的脱苦味是通过选择性地用活性炭去除苦味肽或将它们吸附到疏水树脂上而实现的。在这样的去除步骤中伴随的产量减少增加了最终产物的成本。此外，该方法对终产物的营养值具有负面影响，这是因为几个营养上不可缺少的氨基酸由于它们疏水的特性而丢失，包括色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸。因而，这个方法的脱苦味易于产生缺乏这些营养上重要的氨基酸的水解产物。脱苦味也可以通过将水解产物用外肽酶处理而实现。在这个方法中，将氨基末端和羧基末端的氨基酸从肽中释放以试图减小它们总的疏水性。将肽暴露于非选择性的外切蛋白酶时导致不可控制的量的游离氨基酸释放到最终的水解产物中。如灭菌或喷雾干燥所需要的，随后对这样含有游离氨基酸的水解产物的加热常通过美拉反应而生成无味的液体培养基。此外，通过外切蛋白酶产生的高水平的游离氨基酸可将最终水解产物产品的渗透值增加到可导致渗透性腹泻的水平。因此，蛋白水解产物的生产代表了蛋白水解消化正反两方面之间的平衡。当前的实践是为了产品种类的特殊要求而使蛋白质底物的酶促消化最适化。例如，打算供真正变态反应婴儿使用的蛋白质水解产物需要广泛的蛋白水解消化，随后进行任何残留的大分子量肽片段的严格去除。作为对照的，为很少表现牛奶变态反应的成年人设计的产品一般含有水解产物，其中增加了肽的平均长度以使无味的可能性最小并使得产量最大。所有主要的牛奶蛋白质都被认为是重要的抗原性化合物，例如从β-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白，以及从如大豆分离物、水稻蛋白质和小麦谷蛋白中获得的蔬菜蛋白质组分。因而，认为将这些牛奶和谷类蛋白质酶促消化为分子量低于3000 Da对于使变应原性最小化是重要的。尤其认为乳清中的β-乳球蛋白组分是重要的变态反应原，因为该蛋白质不存在于人乳中且已证实β-乳球蛋白的蛋白水解消化是困难的。含有广泛水解的蛋白质水解产物的婴儿配方一般含有高水平的游离氨基酸，这指示了不最理想的味道和高的重量摩尔渗透压浓度。对当前市场上的婴儿配方水解产品的最近评估显示它们中的许多仍然含有基于乳清的免疫原性物质。该观察显示继续需要可在较低成本导致改善的水解产物的新酶混合物。预定提供给非医疗需要的消费者如运动员或减轻体重的人的蛋白质水解产物必须适应于提供好的味道特征。在这些情况下，高的适口性以及物理化学方面如在酸性环境下的溶解性具有最重要的作用。这个种类的产品(包括强化的果汁和运动饮料)特别关注谷氨酰胺和精氨酸添加剂以改善消费者的健康。例如运动饮料适合增强身体的忍耐力和在延长的高强度锻炼后使运动员恢复。已认为富含谷氨酰胺的谷类蛋白质来源如小麦谷蛋白或富含精氨酸的蛋白质来源如水稻蛋白质和大豆分离物是牛奶蛋白质的替换物，以满足酸性健康相关产品的添加剂需要。然而，这样的谷类蛋白质，具体而言地为小麦谷蛋白在更酸性的pH值即那些小于4的pH值时显示了非常差的溶解性，这意味着完全可溶的谷蛋白水解产物难于获得。因为与蛋白质水解相关联的对产品成本和质量的负面影响，几种目标在于改善水解产物特征和降低生产成本的酶混合物已经在以前的出版物中描述。例子包括EP 321 603，它涉及源自动物的内切蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰酶制剂的使用，也包括EP 325986和WO 96/13174，它们偏重从芽孢杆菌属和曲霉属物种获得的内切蛋白酶的使用。已经描述了几种能够使肽混合物脱苦味的外切蛋白酶。然而，例如EP 0223 560涉及特定的脯氨酸特异性内切蛋白酶的用途，WO 96/13174涉及为此目的的氨肽酶和羧肽酶的混合物。许多出版物竭力推荐脯氨酸特异性内切蛋白酶和各种外切蛋白酶组合以生产具有相对低的苦味的蛋白质水解产物。例如，日本专利JP02039896涉及与二肽羧肽酶组合的脯氨酸特异性内切蛋白酶生成低分子量肽制剂的用途。富含脯氨酸的寡肽由3个脯氨酸特异性肽水解酶的降解被描述为对于没有苦味地促进干酪的成熟是基本的(Journal of Dairy Science，77(2)385-392(1994))。更明确地，脯氨酸特异性内切蛋白酶与羧肽酶组合的脱苦味作用描述于JP5015314。JP5015314描述了从米曲霉(Aspergillus oryzae)中获得的粗酶制剂，它除了通常的非特异性蛋白水解活性之外，显示小量的脯氨酸特异性内切蛋白酶和羧肽酶活性。根据JP5015314，在肽的羧基末端存在的脯氨酸残基导致苦味且为不合需要的。将大豆蛋白质与脯氨酸特异性内切蛋白酶和羧肽酶的酶混合物温育可产生一种水解产物，该水解产物的苦味显著地低于用缺乏脯氨酸特异性内切蛋白酶和羧肽酶组合的蛋白酶制剂获得的大豆水解产物。总起来说，本领域的技术表明外肽酶介导的羧基末端(或氨基末端)疏水性氨基酸残基从肽中的释放对于肽水解产物的显著的脱苦味是基本的。同样地，明确地涉及用于脱苦味的脯氨酸特异性内切蛋白酶的参考文献教导人们该活性的功能是将疏水性脯氨酸残基暴露以使得它们随后被羧肽酶去除。这个假说的含义是脯氨酸特异性内切蛋白酶的脱苦味活性是与羧基末端脯氨酸残基的有效去除有关的，而不是与具有这样的羧基末端脯氨酸残基的肽的产生有关。专利技术概述本专利技术提供了一种包含肽的蛋白质水解产物，其中具有羧基末端脯氨酸的肽的摩尔份数(％)比用于生成水解产物的蛋白质底物中脯氨酸的摩尔份数(％)高两倍多。本专利技术也提供了-一种包含肽的乳清水解产物，其中具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性的多肽，该多肽选自：（ａ）一种其氨基酸序列与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２的氨基酸１～５２６具有至少４０％的氨基酸序列一致性的多肽或其片段；（ｂ）一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格性条件下与 （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的核酸序列或其片段杂交，该核酸序列或片段与其在６０个，优选地为１００个核苷酸上具有至少８０％或９０％的一致性，更优选地为在２００个核苷酸上具有至少９０％的一致性，或与（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的核酸序列的互补核酸序列杂交。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PJT戴克，RAM范德霍文，L伊登斯，L德兰格，
申请(专利权)人：DSMIP资产有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]