本发明专利技术提出一种人胎盘来源的MSCs体外表现为抑制T细胞活性及增殖作用机制的检测方法。鉴于协同共刺激分子在T细胞活化增殖中所起的重要作用，本发明专利技术大胆推测胎盘来源的MSCs体外表现出对T细胞负性调控作用可能系其高表达负性协同刺激分子PD-L1有关，首先通过实验验证PMSCS对活化T细胞具有明显抑制作用，再以负性协同刺激分子PD-L1为切入点，通过流式细胞仪检测、免疫荧光染色、3H-TdR掺入法、ELISA等实验分析PD-L1在PMSCS介导的T细胞体外增殖抑制作用中所扮演的角色，从而验证PD1-PD-L1分子通路是PMSCS体外调节T细胞免疫耐受的主要信号机制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术及免疫学领域，特别涉及一种人类AECS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法。
技术介绍
协同共刺激分子在T淋巴细胞的活化增殖中起到很重要的作用。“协同刺激信号”是1970年由Bretseher和Cohn在T细胞活性双信号模型的基础上提出的，即除了通过APC递呈MHC处理过的抗原给抗原特异性T细胞提供第一个信号外，还需协同刺激分子作为辅助信号的协同作用，达到生理活化阈值后才能使T细胞产生正常的免疫调节机制。如果缺乏协同共刺激分子的第二信号，将会导致调节性T细胞的无反应性或特异性免疫耐受。B7家族是唯一能从APC单向传送信号至T细胞的协同共刺激分子，PD-Ll是B7家族一个重要的负性协同刺激分子，抑制T细胞的活化增殖，在机体免疫应答中发挥了重要的调节作用。以往的实验已经验证了 AECS低表达HLA-DR，并对活化的T细胞具有抑制作用，但AECS是否表达与T细胞活化或抑制相关的协同刺激分子以及其中的机理，未见相关的文献报道。以负性协同刺激分子ro-Ll为切入点，通过流式细胞仪检测、免疫荧光染色、3H-TdR掺入法、ELISA等实验分析TO-Ll在AECS介导的T细胞体外增殖抑制作用中所扮演的角色，从而验证HH-PD-Ll分子通路是AECS体外调节T细胞免疫耐受的主要信号机制。
技术实现思路
本专利技术提出一种人类AECS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法，首先在体外分离及培养人AECS，应用免疫荧光染色方法检测AECS表面负性协同刺激分子I3D-Ll的表达，通过I3D-LlmAb阻断实验，AECS与T细胞体外共培养观察T细胞增殖及细胞周期、细胞因子分泌情况等证实其对T淋巴细胞的抑制作用及内在的分子机制，整个验证过程将包括如下步骤S1:羊膜上皮细胞分离培养与鉴定；选用剖宫产后的人羊膜，大小约15*15cm，分离、去除残留的绒毛膜，PBS (Gibco BRL公司)，洗尽血迹后用O. 125%胰酶，37° C消化IOmin,重复4次，IOOOrpm,离心6min收集，用PBS洗3次后接种在含10%FBS+RPMI1640培养皿中，于37° C含5%C02空气的培养箱内培养。每3-4d进行换液，待细胞生长铺满至瓶底80% -90%时传代，培养第二代的细胞用于实验。用于实验之前的细胞进行流式细胞仪检测细胞表型，先将细胞用胰蛋白酶消化，用PBS液调整细胞浓度为IxlO6 / ml。分别加入下列鼠抗人单克隆抗体CD29. FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE、置 4° C 孵育 30min，PBS 洗 2 遍，直接进行流式细胞仪分析。S2 :免疫荧光染色法检测AECS中TO-Ll表达；将以多聚赖氨酸处理的盖玻片置于六孔培养板中，取2代细胞种于此六孔板中。I 2d后吸取培养基，加入4%的多聚甲醛固定细胞，用PBS冲洗后，加入抗人I3D-LlmAb后置于湿盒中4° C过夜，冲洗后再加入PE荧光二抗，置室温Ih,最后加入Hoechst33258五分钟。用50%甘油封片,用突光显微镜观察。S3 =PD-LlmAb阻断AECS对T细胞增殖的抑制作用检测；将2代的AECS用丝裂霉素(IOng / ml)处理，PBS洗三遍,接种于96孔板中IxlO4 /孔，每孔加入T细胞IxlO5 /孔，同时加入 PHA (50 μ g / ml)，实验分为 5 组T、T+PHA、T+PHA+AECS、T+PHA+AECS+antiPDLl、T+PHA+AECS+mlgG组；将细胞于37° C、5 % C02条件下培养72h。在结束前18h加入3H-TdRd U Ci /孔)，收集细胞,用β液体闪烁计数仪检测cpm值,根据cpm值的大小,进行分析比较。S4 =AECS与T细胞体外共培养及I3D-Ll阻断实验；取二代AECS，用IOug / ml的丝裂霉素处理lh，胰酶消化，洗涤5遍，用含有10% FBS的LG-DMEM完全培养基调整浓度为1.OXlO5 /孔，接种于24孔培养板中。接种T细胞7xl06 / ml，加入PHA(30 μ g / ml)或和PD-LlmAbdOy g / ml)同时加入。实验分组为 T、T+AECS、T+PHA+AECS、T+PHA+AECS+PD_L1、T+PHA+AECS+mlgG、AECS。24h 后观察细胞形态。S5 T细胞活性早期标志⑶69的检测；24h后收集各组细胞，调整细胞密度，加入⑶4-FITC、⑶69-PE表记的抗体，进行双标。4° C避光，30分钟，PBS洗两遍，上机检测。S6 =AECS对活化T细胞周期影响的检测；收集上述细胞，PBS洗涤后，70%酒精固定过夜。PBS洗三遍，加入细胞周期染液(PI50yg / ml、RNA酶50yg / ml) O. 5ml, 37° C孵育30min，流式细胞仪分析。S7 =AECS对活化T细胞细胞因子分泌影响的检测；将上述细胞上清收集并分装保存，-20°C _80°C保存待检。IFN- Y、IL-10的检测采用ELISA法，步骤按照试剂盒说明书操作。所述实验流程中所使用的人外周血T淋巴细胞分离纯化的步骤具体如下取健康人外周血(血 样来自自愿者)用淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞，贴壁2h后，吸出富集的T细胞，再经磁珠分选纯化。纯化后的T细胞纯度达95%以上。本专利技术以免疫调控信号机制作为出发点，对AECS在体外所表现出来的免疫抑制特性其内在的分子机制作了探讨，从而成功地明确了负性协同刺激分子ro-Ll—PDl分子信号通路是主要的调控位点，该专利技术为进一步深入探讨机体的复杂免疫调控网络提供了很好的线索。附图说明通过下面结合附图的详细描述，本专利技术前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图1为人类AECS体外培养形态的显微放大图；图2为流式细胞仪测定AECS表面协同刺激分子的表达情况；图3为I3D-LlmAb部分阻断AECS对T细胞增殖的抑制效应；图4为I3D-LlmAb部分逆转AECS对T细胞活化增殖的抑制效应；图5为TO-LlmAb部分逆转AECS对活化T细胞周期的阻滞；图6为I3D-LlmAb调节AECS对T细胞体外细胞因子的分泌；图7为整个实验验证过程流程示意具体实施例方式本专利技术的一种人类AECS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法，其研究目的是进一步了解人类羊膜细胞免疫调控能力及其可能的效应机制，为该技术最终应用于临床、拓展其临床应用适应症提供理论依据。本实验米用的材料和设备包括倒置相差显微镜(日本Olympus公司)、C02培养箱(法国Jouan公司)、恒温离心机(法国Jouan公司)、流式细胞仪(美国Beckman. Coulter公司)、培养瓶和培养板(美国Cotingcostar公司)、β液体闪烁计数仪(瑞典Pharmacia, Uppsala公司)、LG—DMEM培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Sigma 公司)，DMEM(Gibco 公司)，鼠抗人 PD1、CD80、CD83、CD86、CD4、CD69 克隆抗体(eBioscienee本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人类AECS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法，其包括下述步骤：?S1：羊膜上皮细胞分离培养与鉴定；?S2：免疫荧光染色法检测羊膜上皮细胞中PD?L1表达；?S3：PD?L1mAb阻断AECS对T细胞增殖的抑制作用检测；?S4：AECS与T细胞体外共培养及PD?L1阻断实验；?S5：T细胞活性早期标志CD69的检测；?S6：AECS对活化T细胞周期影响的检测；?S7：AECS对活化T细胞细胞因子分泌影响的检测。
【技术特征摘要】
1.一种人类AECS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法，其包括下述步骤 S1:羊膜上皮细胞分离培养与鉴定； 52:免疫荧光染色法检测羊膜上皮细胞中ro-Ll表达； 53=PD-LlmAb阻断AECS对T细胞增殖的抑制作用检测； 54=AECS与T细胞体外共培养及I3D-Ll阻断实验； 55T细胞活性早期标志⑶69的检测； 56=AECS对活化T细胞周期影响的检测； 57=AECS对活化T细胞细胞因子分泌影响的检测。2.如权利要求1所述的一种人类AECS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法，其中所述步骤IAECS的分离及培养过程如下选用剖宫产后的人...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐杰，房文峰，朱爱华，
申请(专利权)人：吴卫江，
类型：发明
国别省市：
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