本发明专利技术公开了一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，包括如下步骤：(1)固体培养；(2)种子培养，将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，在28-35℃，200-280r/min摇床振荡培养，以24h-48h为传代周期，以体积比为1％-10％为传代比接入新的种子培养基中，传代100-200天；(3)分纯；(4)发酵；本发明专利技术的方法通过混菌进化传代培养数十代后，能明显提高巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌的生长速度和氧化葡糖杆菌产2-酮基-L-古龙酸效率，从而可提高对培养基的利用效率，提高L-山梨糖的转化效率10％-15％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于エ业微生物领域，涉及ー种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法。
技术介绍
维生素C是机体营养、生长所必需的ー种微量水溶性维生素，在抗氧化和維持新陈代谢平衡等方面起着重要的作用。维生素C可以作为药品、保健品、食品添加剂及化妆品营养剂，它的应用范围在扩展，市场稳定。目前，我国生产维生素C的方法为“ニ步发酵法”，第一步发酵使用黑醋杆菌将山梨醇转化为L-山梨糖，第二步发酵为混合发酵，将山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。混合发酵所使用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)混菌发酵，其中，氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)为产酸菌，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)为伴生菌,若不加入巨大芽孢杆菌而単独使用氧化葡糖杆菌时，生长极端缓慢，产酸效率低，当加入巨大芽孢杆菌，可使氧化葡糖杆菌生长速率提高，产酸量增加，但是，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)混菌发酵2_酮基_L_古龙酸的转化率尚有可提闻的空间。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供ー种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法。強化两菌相互 作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，包括如下步骤(I)固体培养取存于液氮的10-500 U L保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10-500 ii L保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上，28_35°C，培养24-48小时；(2)种子培养将经步骤(I)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-350C，200-280r/min摇床振荡培养，24h_48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为 2X 107-2X 101Qcfu/ml，使氧化葡糖杆菌的密度为 2 X 108_2 X 10ncfu/ml，在 28_35°C，200-280r/min摇床振荡培养，以24h_48h为传代周期，以体积比为1% -10%为传代比接入新的种子培养基中，传代100-200天；⑶分纯将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28-35°C培养24-48小时；再分别转入种子培养基，在28_35°C，200_280r/min摇床振荡培养24h-48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；(4)发酵将所述进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2 X 107-2 X 101(lCfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为 2X 108-2X 10ncfu/ml，在 28-35°C，200-280r/min 摇床振荡培养 72h_96h，获得 2-酮基-L-古龙酸或将所述原始巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使原始巨大芽孢杆菌的密度为2X 107-2X 101(lCfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为 2X 107-2X 109cfu/ml，在 28-35 °C，200_280r/min 摇床振荡培养 72h_96h，获得 2-酮基~L_古龙酸。固体培养基的制备为按比例称取L-山梨糖10_50g，玉米浆2-10g，牛肉膏 2-10g,酵母浸粉 2-10g,尿素 0. 5-5g，蛋白胨 2-12g，琼脂 10_50g，KH2PO4O. 5_5g，MgSO4O. 1-0. 7g, CaCO3O. 5_5g，加水至 1L，调 pH 为 6. 5-7. 0，121°C灭菌 20min，制成固体培养基。 固体培养基的制备优选的是按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉 3g，尿素 Ig,蛋白胨 IOg,琼脂 20g,KH2PO4Ig,MgSO4O. 2g，CaCO3Ig,加水至 1L，调 pH 为6. 8，121°C灭菌20min，制成固体培养基。种子培养基制备为按比例称取L-山梨糖10_50g，玉米浆2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉 2-10g，尿素 0. 5-5g，蛋白胨 2-12g，KH2PO4O. 5_5g，MgSO4O. 1-0. 7g，CaCO3O. 5_5g，加水至1L，调pH为6. 5-7. 0，121°C灭菌20min,制成种子培养基。种子培养基的制备优选的是按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素 lg，蛋白胨 10g,KH2PO4Ig,MgSO4O. 2g，CaCO3Ig,加水至 1L，调 pH为 6. 8，121 °C灭菌20min,制成种子培养基。发酵培养基制备为按比例称取L-山梨糖40_120g，玉米浆10_50g，尿素10_25g，KH2PO4O. 5-3g, MgSO4O. 2-1. 2g, CaCO3O. 5_5g 加水至 1L，调 pH 为 6. 5-7. 5，121°C灭菌 20min,制成发酵培养基。发酵培养基的制备优选的是按比例称取L-山梨糖80g，玉米浆20g，尿素12g，KH2PO4Ig, MgSO4O. 5g，CaCO3Ig,加水至 1L，调 pH 为 7. 0，121°C灭菌 20min，制成发酵培养基。本专利技术的方法通过混菌进化传代培养数十代后，能明显提高巨大芽孢杆菌(Baclilus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的生长速度和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)产2_酮基_L_古龙酸效率,从而可提高对培养基的利用效率，提高L-山梨糖的转化效率10% -15%。附图说明图1为传代过程2-酮基-L-古龙酸转化率变化，图例 :2_酮基-L-古龙酸转化率。图2为传代100天后菌种交叉搭配发酵結果。图3为传代150天后菌种交叉搭配发酵結果。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进ー步的说明。下面的内容及实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本专利技术，但并不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)保藏编号为CGMCCNo.1. 110,巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)保藏编号为CGMCC No1. 459,从中国普通微生物菌种保藏管理中心购得。实施例1強化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，包括如下步骤(I)固体培养固体培养基的制备为按比例称取L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素 lg，蛋白胨 10g，琼脂 20g, KH2PO4Ig, MgSO4O. 2g，CaCO3Ig 加水至 1L，调 pH 为 6.8，121°C灭菌20min，制成固体培养基；将存于液氮的150 UL保藏于体积浓度为20%的甘油水溶液中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种强化两菌相互作用提高2?酮基?L?古龙酸产量的方法，其特征是包括如下步骤：(1)固体培养：取10?500μL保藏于体积浓度为15?30％的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter?oxydans)和10?500μL保藏于体积浓度为15?30％的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus?megaterium)分别接种于固体培养基上，28?35℃，培养24?48小时；(2)种子培养：将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28?35℃，200?280r/min摇床振荡培养，24h?48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2×107?2×1010cfu/ml，使氧化葡糖杆菌的密度为2×108?2×1011cfu/ml，在28?35℃，200?280r/min摇床振荡培养，以24h?48h为传代周期，以体积比为1％?10％为传代比接入新的种子培养基中，传代100?200天；(3)分纯：将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28?35℃培养24?48小时；再分别转入种子培养基，在28?35℃，200?280r/min摇床振荡培养24h?48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；(4)发酵：将所述进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×107?2×1010cfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×108?2×1011cfu/ml，在28?35℃，200?280r/min摇床振荡培养72h?96h，获得2?酮基?L?古龙酸或将所述原始巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使原始巨大芽孢杆菌的密度为2×107?2×1010cfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×107?2×109cfu/ml，在28?35℃，200?280r/min摇床振荡培养72h?96h，获得2?酮基?L?古龙酸。...
【技术特征摘要】
1.一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征是包括如下步骤(1)固体培养取10-500yL保藏于体积浓度为15-30 %的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10-500 μ L保藏于体积浓度为15-30 %的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上,28_35°C,培养24-48小时；(2)种子培养将经步骤(I)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35°C，200-280r/min摇床振荡培养，24h_48h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为 2X107-2X1010cfu/ml,使氧化葡糖杆菌的密度为 2X 108_2X 10ncfu/ml，在 28_35°C，200-280r/min摇床振荡培养，以24h_48h为传代周期，以体积比为1% -10%为传代比接入新的种子培养基中，传代100-200天；(3)分纯将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯，再分别接种于固体培养基上，28-350C培养24-48小时；再分别转入种子培养基，在28-35 V，200-280r/min摇床振荡培养24h-48h，得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液；(4)发酵将所述进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2X107-2X101(lCfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为 2X108-2X10ncfu/ml,在 28-35 °C，200_280r/min 摇床振荡培养 72h_96h,获得 2-酮基-L-古龙酸或将所述原始巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中，使原始巨大芽孢杆菌的密度为2X 107-2X 101(lCfu/ml，使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为 2X 107-2X 109cfu/ml，在 28-35 °C，200_280r/min 摇床振荡培养 72h_96h,获得 2-酮基_L_古龙酸。2.根据权利要求1所述的一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征是所述固体培养基的制备为按比例称取L-山梨糖10-50g，玉米浆2-10g，牛肉膏 2-10g,酵母浸粉 2...
【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，邹旸，吕亚金，胡梦龙，汪洋，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：
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