一种用人工蛋白类荧光探针对活细胞进行细胞质特异性标记的方法技术

本发明专利技术提供了一种用人工蛋白类荧光探针对活细胞进行细胞质特异性标记的方法，其特征在于包括：配制氨基酸-壳聚糖多肽接枝共聚物悬液；将配制好的接枝共聚物悬液分散于DMEM高糖培养液中；用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰蛋白酶把CHL(中国仓鼠肺成纤维细胞)细胞消化为单细胞悬液；孵育所述CHL细胞；弃掉原液；加入分散有接枝共聚物悬液的所述DMEM高糖培养液；继续培养预定的时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，具体涉及的应用，在紫外光的激发下，这种探针可以在活细胞体内产生蓝色荧光。
技术介绍
在近些年的生物医学研究领域里，研究者常利用自发光的荧光分子来对生物体进行标记，使原本透明的细胞或细胞器在黑暗的显微镜视场中显露出来。2008年，下村修、马丁 沙尔菲、钱永健三位科学家以绿色荧光蛋白的发现及应用获得了诺贝尔奖。下村修在提取水母素时发现了绿色荧光蛋白，马丁 ·沙尔菲通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物产生绿色荧光蛋白，证实了绿色荧光蛋白与活体生物的相容性，建立了利用绿色荧光蛋白研究基因表达的基本方法。钱永健研究了绿色荧光蛋白的工作原理以及发光机制，并通过改变基因序列等化学改造手段，将其研究的红色、蓝色、黄色荧光蛋白应用在生物学、遗传学、生命科学等领域。钱永健将红、黄、青3种荧光色素嵌入老鼠基因组，随后用来自细菌的重组基因激活这些色素基因。通过在老鼠不同部位或不同发育阶段使用不同色素基因，成功为老鼠的不同细胞涂上不同颜色，这就是2007年轰动科学界的“脑虹”现象。2010年，钱永健课题组研制出一种荧光液体，这种注射型液体可使患者体内通常不可见的神经发光现形。荧光蛋白对神经的特异性标记使其与周围组织区别开来，这种差异比利用其他方式产生的差异要大10倍，为外科手术提供了重要的辅助工具。这些研究的成功，使得荧光蛋白在显微医学和临床医学等应用上有了重大突 破。尽管利用蛋白质自发荧光实现标记的研究已取得了很大进展，但仍存在着许多亟待解决的问题，如对于细胞内存在的各种复杂情形而言的小分子标记物，其标记的特异性目前仍具有挑战性，尚未在真正意义上实现生物活体内各类蛋白质的实时观测、动态研究。 另外，蛋白类荧光探针也有其固有缺点(I)需要从蛋白质中提取氨基酸片段，实施过程复杂；(2)绿色荧光蛋白由238个氨基酸组成，它较大的体积在作为荧光探针时容易干扰其他蛋白的正常生理活动甚至阻碍其达到研究目的；(3)荧光稳定性差，且蛋白容易失活；(4) 以特异性的标记表达与检测为主，缺乏普遍适用性。巯基化合物是生物体内重要的生物活性物质，可作为细胞内的抗氧化剂，参与蛋白质和DNA的合成以及物质的运输和新陈代谢等生理活动。半胱氨酸是生物体内非常重要的巯基类化合物，具有抑菌和解毒等独特的功能，生物体内半胱氨酸的含量变化或代谢失调均会导致一些疾病的发生。正因如此，科研人员一直不懈努力，试图开发出各种特异性的荧光探针来检测生物体内巯基化合物。然而对巯基的自发荧光特性几乎无人问津。因此， 巯基类自发荧光探针对细胞的标记特性目前尚属缺乏。本专利技术中通过将自然界唯一的碱性多糖-壳聚糖与丰富、价廉的L-半胱氨酸进行人工接枝聚合，制备出氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物，研究其自发荧光特性及共聚物对细胞特异性标记。由于该共聚物合成原料来源丰富，共聚物与细胞生物相容性好使得该共聚物有望成为目前昂贵染料的替代品，为临床医学、生物分析等提供新的方法，同时为新型自发荧光探针的研究开创新的研究思路和研究体系。
技术实现思路
根据本专利技术的一个方面，提供了，其特征在于包括配制氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物悬液；将配制好的接枝共聚物悬液分散于DMHM培养液中；用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰蛋白酶把CHL(中国仓鼠肺成纤维细胞)细胞消化为单细胞悬液；孵育所述CHL细胞；弃掉原液；加入分散有接枝共聚物悬液的所述DMEM培养液；继续培养预定的时间。附图说明图1显示了紫外照射下在灭菌水中接枝聚合物的荧光现象。图2-5显示了在本专利技术的各实施例中，在紫外光的激发下，用荧光显微镜观察接枝共聚物与高糖培养液组成的悬液在与中国仓鼠肺成纤维细胞共培养后的细胞内荧光情况。图6是在本专利技术的一个实施例中，在紫外光激发作用下CLSM光切单个标记CHL细胞的图像。具体实施方式本专利技术的目的是提供，弥补目前细胞标记领域里费时、成本高、细胞损伤大的缺点，提供一种简便、细胞损伤小、生物相容性好的蛋白类荧光探针，利用其中能自发荧光的巯基作为生色团，这类探针可以对活细胞的细胞质进行标记与检测，为临床医学、生物分析等提供新的方法。根据本专利技术的一个方面，提供了，其特征在于包括配制氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物悬液；将配制好的接枝共聚物悬液分散于DMEM高糖培养液中；用EDTA-胰蛋白酶把CHL(中国仓鼠肺成纤维细胞)细胞消化为单细胞悬液；孵育所述CHL细胞；弃掉原液；加入分散有接枝共聚物悬液的所述DMEM培养液；继续培养预定的时间。根据本专利技术的更具体的方面，为了实现上述目的，本专利技术采用以下措施这类蛋白类自发荧光探针主要通过半胱氨酸的巯基的保护、半胱氨酸环内酸酐的合成、半胱氨酸环内酸酐开环聚合与壳聚糖发生接枝共聚反应制备氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物粉末-荧光探针，紫外照射约IOmin后将其分散于灭菌水中，利用其特性制备此探针的悬液，并与DMEM高糖培养液混合，与中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)在37°C、5%体积分数的CO2培养箱中共同孵育，荧光探针通过微粒扩散、细胞内吞等方式进入细胞质，实现对细胞的标记。一种氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物荧光探针标记细胞的方法，其具体实施步骤如下1、配制O. 126mol/mL和1. 031mol/mL的氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物悬液。 将氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物固体粉末紫外照射约IOmin后加入适量灭菌水，并用超声器超声分散，时间为7h，保持超声器每工作20min停歇lOmin。将分散好的接枝共聚物水溶液分散于DMEM高糖培养液中，保存于4°C冰箱中备用；2、CHL细胞在DMEM高糖培养液中培养至铺满培养瓶80%以上时，用体积比为 O. 05%的乙二胺四乙酸(EDTA)-胰蛋白酶消化为单细胞悬液，并用血球计数板计数后，将其配为1. OX IO4个/mL、2. 5 X IO4个/mL、4. 5 X IO4个/mL的细胞悬液，分装至底部铺有盖玻片的六孔板，在37°C、5%体积分数的CO2培养箱中孵育，使细胞正常贴壁生长，得到实验所需的细胞生长状态；3、待上一步的CHL细胞孵育24h后，弃掉原液，加入第一步配好的溶有荧光探针 (氨基酸-壳聚糖多肽类接枝共聚物)的DMEM高糖培养液，继续培养6-48h。4、选择预设时间点，每隔6h、12h、24h取出六孔板，弃掉原液，用PBS (磷酸缓冲液) 冲洗3次，约5min/次。然后，放置于荧光显微镜下观察荧光探针对CHL细胞标记的情况， 所采用的激发光是紫外光。 所述的荧光探针通过半胱氨酸的巯基的保护、半胱氨酸环内酸酐的合成、半胱氨酸环内酸酐开环聚合与壳聚糖发生 接枝共聚反应制备而成。所述的细胞为中国仓鼠肺成纤维细胞。本专利技术与现有荧光探针标记技术相比有以下优点和作用本专利技术所用的荧光探针对细胞标记效果良好，操作简单易行，与细胞的生物相容性好，光稳定性好；无需引入其他有机染料，对细胞损伤度低，且在48h内几乎无毒。细胞被标记后稳定性好，这类探针可以对活细胞的细胞质进行标记与检测，在医学诊断里，可以通过信号传导和细胞的迁移来诊断疾病。1、提供自发荧光探针的应用途径。本专利技术的技术方案为1、自发荧光探针的结构本专利技术的自发荧光探针的结构式为这一蛋白类自发荧光探针主要通过半胱氨酸的巯基的保护、半胱氨酸环内酸酐的合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用人工蛋白类荧光探针对活细胞进行细胞质特异性标记的方法，其特征在于包括：配制氨基酸?壳聚糖多肽类接枝共聚物悬液；将配制好的接枝共聚物悬液分散于DMEM高糖培养液中；用乙二胺四乙酸?胰蛋白酶把中国仓鼠肺成纤维细胞细胞消化为单细胞悬液；孵育所述中国仓鼠肺成纤维细胞细胞；弃掉原液；加入分散有接枝共聚物悬液的所述DMEM高糖培养液；继续培养预定的时间。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：相艳，司江菊，武素芳，
申请(专利权)人：北京航空航天大学，
类型：发明
国别省市：