本发明专利技术公开一种药物筛选方法、用于促进胞外基质交联的药物及其应用，所述药物筛选方法，用于筛选出对LOXL1基因表达有促进作用的物质，其中，所述药物筛选方法中，包括以下步骤：A、构建由人LOXL1基因启动子控制表达ZsGreen的二代慢病毒载体；B、用二代慢病毒载体感染人成纤维细胞，构建整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞；C、药物筛选：将所述整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞接种于培养基中，将待测物质加入到人成纤维细胞的细胞培养基中；培养；通过检测绿色荧光强度是否增加来判断待测物质对LOXL1基因表达的促进作用。本发明专利技术所提供的方法操作简单，具有广泛的适用性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药领域，尤其涉及一种药物筛选方法、用于促进胞外基质交联的药物及其应用。
技术介绍
弹性纤维为多种器官提供弹性， 而胶原蛋白为机体提供支撑作用。 现在已知，弹性纤维交联度的降低会导致一系列的结缔组织的病变，例如皮肤松弛、肺气肿、心血管异常、血管增生诱发的视网膜黄斑退变、性器官脱垂及尿失禁。这些病变均属老年性慢性病，虽然不致死但大大影响人们的生活质量。因此，探索提高机体的弹性纤维的维护是提高人们生活质量的重要手段。弹性蛋白多聚体沉积是弹性纤维维持交联度的一个重要因素，早于2004及2006年，Liu 及其同事发现赖酰基氧化酶1 （Lysyl oxidase-like 1, LOXL1） 是特异地维护机体弹性纤维的发育及其更新的关键因子。没有LOXL1直接特异性地影响弹性纤维的交联形成，进而导致一系列的动态结缔组织的病变，包括皮肤松弛、肺气肿、心血管异常、血管增生诱发的视网膜黄斑退变、性器官脱垂及尿失禁。进一步研究发现，随着组织器官的老化，LOXL1的水平大大降低，并伴随着弹性纤维交联度的下降及弹性蛋白单体无序堆积的增加。这些发现揭示通过增强LOXL1蛋白的表达水平或活性能延缓生物有机体胞外基质的衰老过程（Nature Genetics 2004 (36):178， Am J Path 2006（168）: 519； IOVS 2008 （49）:2599；WO/2005/069975，US Patent 7255856，US Patent 7255857，European patent EP1706139）。<br>但是，现有技术还有没有出现一种药物筛选方法，能用于筛选出对LOXL1蛋白的表达水平或活性有效促进作用的物质。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种药物筛选方法、用于促进胞外基质交联的药物及其应用，旨在解决现有技术中没有方法能有效筛选出能用于筛选出对LOXL1蛋白的表达水平或活性有效促进作用的物质的问题。本专利技术的技术方案如下：一种药物筛选方法，用于筛选出对LOXL1基因表达有促进作用的物质，其中，所述药物筛选方法中，包括以下步骤： A、构建由人LOXL1基因启动子控制表达ZsGreen的二代慢病毒载体：将人LOXL1基因启动子片段克隆到慢病毒载体pLVX-ZsGreen上，并将慢病毒载体pLVX-ZsGreen上原有的CMV启动子置换下来，得到二代慢病毒载体pLenti-PLOXL1-ZsGreen，所述二代慢病毒载体pLenti-PLOXL1-ZsGreen含有由人LOXL1基因启动子控制表达ZsGreen的元件PLOXL1-ZsGreen；B、用二代慢病毒载体感染人成纤维细胞，构建整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞；C、药物筛选：将所述整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞接种于培养基中，贴壁过夜；将待测物质溶解于DMSO中并加入到人成纤维细胞的细胞培养基中；经过培养后，检测人成纤维细胞的绿色荧光强度，通过检测绿色荧光强度是否增加来判断待测物质对LOXL1基因表达的促进作用。所述的药物筛选方法，其中，所述步骤B的具体过程为：将二代慢病毒包装体系包装并浓缩成滴度不低于1x107/ml 的病毒颗粒，按1：100 稀释，用于感染细胞密度为20%的人成纤维细胞，经流式分选仪筛选出稳定整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞系。所述的药物筛选方法，其中，所述步骤C中，所述待测物质是以0.2-2 mg/ml溶解于DMSO中；所述细胞培养基中待测物质的最终浓度为1-10 μg/ml。一种用于促进胞外基质交联的药物，其中，所述药物中包含有对LOXL1基因表达有促进作用的物质，所述物质为采用如上所述的药物筛选方法筛选所得。所述的用于促进胞外基质交联的药物，其中，所述药物包括蕲蛇、大青叶、三尖杉、白芥子、白术、甘草、瓜萎、冬瓜皮、桑葚、米召、白前、马勃、月季花、儿茶、玫瑰、生地、泽兰、黄柏、老鸹草、藿香、佩兰、芥子、益母草、茺蔚、木蝴蝶、防己、五味子、刺葵藜、川贝、土茯苓、王木留、郁金、红景天或大黄素中的一种或多种。一种如上所述的用于促进胞外基质交联的药物的应用，其中，将所述用于促进胞外基质交联的药物用作化妆品添加剂、食品添加剂，或用于制备治疗或改善因动态结缔组织病变所致的疾病的药物。有益效果：本专利技术中提供了一种能用于筛选对人LOXL1启动子的活性和LOXL1的表达量有促进的药物的方法，此方法操作简单，而且本专利技术还具有广泛的适用性。本专利技术中通过对上千个中药提取物及化学小分子的筛选，发现了一系列能提高衰老的人成体细胞中LOXL1水平的中草药抽提物及小分子。这些物质都能有效地促进人LOXL1启动子的活性和LOXL1的表达量，从而促进胞外基质蛋白的交联，胞外基质蛋白包括但不局限于弹性蛋白和胶原蛋白。因此，可将所述用于促进胞外基质交联的药物用作化妆品添加剂、食品添加剂，或用于制备治疗或改善因动态结缔组织病变所致的疾病的药物。附图说明图1为本专利技术实施例1中人LOXL1基因启动子的克隆及其活性荧光示踪成细胞稳定株的构建的示意图。图2为本专利技术实施例2中加与不加中草药处理后，ZsGreen荧光强度的检测结果图。图3a为本专利技术实施例3中分别加入32种中草药处理后，ZsGreen荧光强度的检测结果图。图3b为本专利技术实施例3中对数个经药物后的细胞抽提液进行免疫印迹实验的实验结果图。图3c为本专利技术实施例3中对数个经药物后的细胞抽提液进行免疫印迹实验的实验结果图。图4a为本专利技术实施例4中加与不加大黄素处理后，ZsGreen荧光强度的检测结果图。图4b为本专利技术实施例4中加与不加大黄素处理后，细胞数的检测结果图。图4c为本专利技术实施例4中用不同浓度的大黄素处理后，，ZsGreen荧光强度的检测结果图。图5a1为本专利技术实施例5中加与不加大黄素处理后，人成纤维细胞系HF1中人LOXL1基因mRNA水平。图5a2为本专利技术实施例5中加与不加大黄素处理后，人成纤维细胞系HF1中人LOXL1水平的免疫印迹试验结果图。图5a3为本专利技术实施例5中用不同浓度的大黄素处理后，人成纤维细胞系HF1中人Dimer水平的免疫印迹试验结果图。图5b1为本专利技术实施例5中加与不加大黄素处理后，人成纤维细胞系HF2中人LOXL1基因mRNA水平。图5 b 2为本专利技术实施例5中加与不加大黄素处理后，人成纤维细胞系HF2中人LOXL1水平的免疫印迹试验结果图。图5 b 3为本专利技术实施例5中用不同浓度的大黄素处理后，人成纤维细胞系HF2中人Dimer水平的免疫印迹试验结果图。图6a1为本专利技术实施例6中加不同浓度的大黄素处理后，人成纤维细胞系HF1中锁链素（Desmosine）水平的免疫印迹试验结果图。图6a2为本专利技术实施例6中加不同浓度的大黄素处理后，人成纤维细胞系HF1中羟基脯氨酸 (Hydroxylp本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种药物筛选方法，用于筛选出对LOXL1基因表达有促进作用的物质，其特征在于，所述药物筛选方法中，包括以下步骤：？A、构建由人LOXL1基因启动子控制表达ZsGreen的二代慢病毒载体：将人LOXL1基因启动子片段克隆到慢病毒载体pLVX？IRES？ZsGreen1上，并将慢病毒载体pLVX？ZsGreen上原有的CMV启动子置换下来，得到二代慢病毒载体pLenti？PLOXL1？ZsGreen，所述二代慢病毒载体pLenti？PLOXL1？ZsGreen含有由人LOXL1基因启动子控制表达ZsGreen的元件PLOXL1？ZsGreen；B、用二代慢病毒载体感染人成纤维细胞，构建整合有PLOXL1？ZsGreen元件的人成纤维细胞；C、药物筛选：将所述整合有PLOXL1？ZsGreen元件的人成纤维细胞接种于培养基中，贴壁过夜；将待测物质溶解于DMSO中并加入到人成纤维细胞的细胞培养基中；经过培养后，检测人成纤维细胞的绿色荧光强度，通过检测绿色荧光强度是否增加来判断待测物质对LOXL1基因表达的促进作用。
【技术特征摘要】
1.一种药物筛选方法，用于筛选出对LOXL1基因表达有促进作用的物质，其特征在于，所述药物筛选方法中，包括以下步骤：
A、构建由人LOXL1基因启动子控制表达ZsGreen的二代慢病毒载体：将人LOXL1基因启动子片段克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1上，并将慢病毒载体pLVX-ZsGreen上原有的CMV启动子置换下来，得到二代慢病毒载体pLenti-PLOXL1-ZsGreen，所述二代慢病毒载体pLenti-PLOXL1-ZsGreen含有由人LOXL1基因启动子控制表达ZsGreen的元件PLOXL1-ZsGreen；
B、用二代慢病毒载体感染人成纤维细胞，构建整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞；
C、药物筛选：将所述整合有PLOXL1-ZsGreen元件的人成纤维细胞接种于培养基中，贴壁过夜；将待测物质溶解于DMSO中并加入到人成纤维细胞的细胞培养基中；经过培养后，检测人成纤维细胞的绿色荧光强度，通过检测绿色荧光强度是否增加来判断待测物质对LOXL1基因表达的促进作用。
2.根据权利要求1所述的药物筛选方法，其特征在于，所述步骤B的具体过程为：
将二代慢病毒包装体系包装并浓缩成...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘小青，应明，蹇丽华，
申请(专利权)人：上海市第十人民医院，
类型：发明
国别省市：
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