本发明专利技术公开了一种使用胚胎干细胞构建的药物筛选模型，进行药物药效初步筛选与评价。胚胎干细胞在药物诱导下定向分化成特定类型细胞，构建高效率药物筛选模型，利用该模型进行药物药效初步筛选和评估。只要药物可在分化的某一个或某几个阶段起作用，就可对药物的药效进行初步评估。本模型具有高效药物筛选的特性，评估指标直接、明确，可对许多天然药物的药理作用进行快速评估。另外，本药效筛选模型所需试剂、时间和经费相对较少，富含细胞分化信息，具备高效率与高仿真以及兼顾药效与机制研究的优势。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于再生医学领域，涉及一种药效筛选模型的建立及应用，主要是关于药物诱导胚胎干细胞体外分化中药活性成分药效筛选模型的建立及应用，可高效率地对中药药效进行快速筛选与评估。
技术介绍
经典的药效筛选模型包括(I)整体动物水平的药效筛选模型其优点是可以从整体水平，直观反映药物的治疗作用；缺点是需要大量动物，实验周期长，需要大量供试品，不适用于药效的初步大规模筛选；(2)组织器官(如离体心脏)水平的药效筛选模型主要缺点是不能反映神经和体液对器官药理效应的调节作用，且其筛选规模小、效率低、样品需求量较大。(3)细胞水平的药效筛选模型有较好的代表性，供试品用量少，可实现大规模筛选。其局限性在于不能反映药物对某一类型细胞在持续发育过程中的作用信息，可供药效评价的指标较少。(4)基因水平的药效筛选模型，可以大规模、高通量、快速筛选药物活性成分，评价药效。但此模型尚不能体现药物对生命体活动的影响过程及药物与大分子作用时重要生命过程变化的性质(如基因调控、蛋白质翻译后修饰，信号传导级联等)。研究胚胎干细胞(ES细胞)体外定向分化成单一类型细胞(心肌细胞、神经细胞、内皮细胞等)起始于90年代，主要用于(I)转化医学研究；(2)再生医学研究；(3)发育生物学研究。ES细胞具有体外不分化的永久增殖能力，当处于合适的培养条件下，可定向分化形成某些单一类型细胞。国外在本世纪初即开始研究ES细胞的体外定向分化，已有ES细胞定向分化成心肌细胞、神 经细胞、内皮细胞等的报道，但ES细胞的分化成功率远低于药物诱导的分化成功率。干细胞用于药物筛选的工作在国外刚刚开始，国内尚在起步阶段。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用ES细胞在特定条件下，可分化成单一类型细胞的性质，在药物诱导下，使ES细胞在体外分化成特定细胞，构建高效率药效筛选模型，并利用该模型进行药物药效初步筛选与评价。本专利技术主要分以下几个步骤1.利用已有的ES细胞的支持培养；2.药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养；3.利用该模型进行药效筛选与评估。本专利技术利用已有的ES细胞的支持培养，其特征是选用小鼠胚胎干细胞D3细胞株(ES-D3细胞株)，接种于滋养层细胞上，按常规方法进行传代培养。本专利技术进行的药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养，其特征是当诱导定向分化为单一类型细胞时，这类细胞包含心肌细胞，用培养基将ES-D3细胞制成单细胞悬液，再悬滴培养成拟胚体，拟胚体进行贴壁培养，加入供试药物共同培养，当拟胚体细胞团出现特定标志，则以此作为定向分化成功的指标。对诱导ES细胞定向分化为心肌细胞时，拟胚体细胞团出现的特定标志是有节律地搏动。根据药物诱导拟胚体细胞团出现的特定指标，及药物诱导分化的时效关系和量效关系进行统计学分析，以此作为药效评价标准。测试药物可以是黄芪、淫羊藿苷、葛根素、银杏黄酮、丹参等中药活性物质。本专利技术所用的培养基是DMEM培养基、胎牛血清。用本专利技术方法可构建心肌细胞定向分化模型、神经元定向分化模型、血管发生定向分化模型等多种单一类型细胞模型，用于相关药物的药效初步筛选与评价。利用本专利技术方法诱导ES细胞定向分化为心肌细胞，还可进行心肌发育依赖性特殊基因表达的研究、心肌结构蛋白表达研究和离子通道形成研究。本专利技术具有以下优点1.应用面非常广ES细胞具有体外不分化的无限增殖能力，构建药物诱导ES细胞体外定向分化形成单一类型细胞(如心肌细胞、神经细胞、内皮细胞等)的药效筛选模型，可初步评价以心脏、神经、血管等为作用靶点的多种新型药物的药效。药物在诱导过程中，可能通过干预多个环节使ES细胞定向分化为某种单一类型细胞，因此在该模型的应用中，只要药物具有干预其中某个或几个关键环节的作用，就可初步评价药物的药效。2.生物信息量大、特异性强ES细胞体外定向分化体系由于能够基本模拟乃至重现体内复杂的发育及组织器官生成过程，具备能人工控制、干预的特点；并且可专一性地通过ES细胞在定向分化过程中，在细胞信号转导、基因表达调控等方面高度模拟药物在整体动物中的作用，重现药物对生物大分子调控的生命现象本质，为新药研制提供了简单有效的体外药效评价模型。3.对有诱导ES细胞定 向分化为某种单一类型细胞的创新药物，该筛选模型由于可呈现分化的全过程，亦可提供药物作用特异性靶点研究，并有可能发现一些有治疗功能的基因。4.观察与评价指标直观、明了，能直观地反映药物的时效关系和量效关系，用于客观评价药效。如ES细胞与具有治疗心脏疾病药效的创新药物共培养后，以ES细胞形成的拟胚体是否具有自发的节律性搏动为评价终点，如获得的时效关系及量效关系资料与对照组有显著性差异，即可明确其对ES细胞定向分化有诱导作用。5.该药效筛选模型仍保持常规的细胞层面筛选药物活性的一般特点，如所需供试品用量少、节时省钱、效率高等，但由于在定向分化过程中富含发育依赖性生物信息，能提供更多的靶点供药效评价用，因此是一个高效率、高仿真兼顾，药效与机制研究并存的药效筛选模型，在新型药物研制、中药活性物质药效评价领域应用前景十分广阔。附图说明图1为中药单体银杏黄酮诱导ES-D3细胞定向分化为心肌细胞的时效关系曲线和量效关系曲线图。具体实施例方式实施例一中药单体银杏黄酮诱导ES细胞定向分化为心肌细胞的研究1. ES细胞的支持培养ES-D3细胞在条件培养基(含DMEM培养基、胎牛血清)中，按2xl07 5xl07个/ml的密度接种于滋养层细胞(小鼠成纤维细胞或STO细胞株)上，按常规方法进行传代培养。2.药物诱导ES细胞定向分化为心肌细胞的培养①ES-D3细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，按20 30uL接种于培养皿的盖子内表面上，培养皿内加入IOmL ES-Hanks溶液，将盖子翻转形成悬滴，置培养箱中悬滴培养2天。此后将悬滴转入盛有IOmL ES细胞分化培养基(DMEM培养基、胎牛血清)的培养皿中，进行ES细胞集落悬浮培养3天，形成ES细胞拟胚体。②附着ES细胞的分化培养在显微镜下用吸管将拟胚体转移到24孔板内，孵育4 5小时，使其吸附后，每孔中缓慢加入ImlES分化培养基，加入中药单体银杏黄酮与ES细胞拟胚体共孵育。此时开始用倒置显微镜每天观察细胞，以捕捉心肌细胞开始跳动的最初时间。2.用该模型进行药效评价若拟胚体细胞团能有节律性地搏动，则以此作为定向分化成心肌细胞的指标，作出药物银杏黄酮对ES-D3细胞诱导分化的时效关系曲线和量效关系曲线，结果见附图1，以此作为药效评价的指标。附图1中，银杏黄酮终浓度分别为系列1:0，系列2 :10_8mol/L，系列3 :10_7mol/L，每个浓度η = 400拟胚体，相同实验重复做了 6次。分别对5种心脏疾病疗效明确的药物(如银杏黄酮、丹参、黄芪、淫羊藿苷、葛根素等)进行诱导分化试验。结果其中有3种药物分别在与ES-D3细胞共培养5 7天时，就有90%以上的细胞克隆出现节律性搏动，并有心脏胚芽纤维蛋白表达上调。另有2种药物与ES-D3细胞共培养9 11天时，均有80%以上的细胞克隆出现节律性搏动，同时可见心肌发育依赖性基因上调。其中以中药单体银杏黄酮的诱导作用最明显，且具有很好的量效关系。`实施例二 心肌发育依赖性特殊基因表达的研究若药物能诱导ES细胞定向分化为心肌细胞，则分别在药物共本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胚胎干细胞体外定向分化药物筛选模型的构建及应用，其特征是：在药物诱导下，使胚胎干细胞(ES)定向分化成单一类型细胞，构建高效率药效筛选模型，并利用该模型进行中药活性成分药效筛选和评估，本专利技术主要分以下几个步骤：(1)利用已有的ES细胞的支持培养；(2)药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养；(3)利用该模型进行药效筛选与评估。
【技术特征摘要】
1.一种胚胎干细胞体外定向分化药物筛选模型的构建及应用，其特征是在药物诱导下，使胚胎干细胞(ES)定向分化成单一类型细胞，构建高效率药效筛选模型，并利用该模型进行中药活性成分药效筛选和评估，本发明主要分以下几个步骤 (1)利用已有的ES细胞的支持培养； (2)药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养； (3)利用该模型进行药效筛选与评估。2.如权利要求1所述的利用已有的ES细胞的支持培养，其特征是选用小鼠胚胎干细胞D3细胞株(ES-D3细胞株)，接种于滋养层细胞上，按常规方法进行传代培养。3.如权利要求1所述的药物诱导ES细胞定向分化为单一类型细胞的培养，其特征是当诱导定向分化为单一类型细胞时，这类细胞包含心肌细胞，用培养基将...
【专利技术属性】
技术研发人员：田杰，
申请(专利权)人：北京清美联创干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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