本发明专利技术提供促进胰腺内胚层细胞分化成胰腺内分泌富集聚簇并增强激素表达细胞中的胰岛素表达的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化 相关申请的交叉引用 本申请要求于2012年6月8日提交的美国临时专利申请序列号61/657, 160的权 益，其全文以引用方式并入本文以用于任何目的。
本专利技术在细胞分化领域中。更具体地，本专利技术公开了肝配蛋白配体和鞘氨 醇-1-磷酸作为多能干细胞向内分泌细胞分化的调节因子的用途。
技术介绍
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集 中在开发适于植入的胰岛素生成细胞或0细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞诸如 例如胚胎干细胞产生功能性0细胞。 在脊椎动物的胚胎发育中，多能细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个 胚层（外胚层、中胚层和内胚层）的细胞群体。组织（诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏） 将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是定形内胚层的形成。定形内胚 层细胞表达多种标记物，诸如HNF3 P、GATA4、MIXL1、CXCR4和S0X17。 到原肠胚形成为止，内胚层划分成可通过一组因子的表达来识别的前-后域，所 述因子唯一地标记内胚层的前、中和后区。例如，Hhex和Sox2鉴定内胚层的前区，而Cdxl、 2和4鉴定内胚层的后半部分。 内胚层组织的迁移使内胚层与不同的中胚层组织紧密接近，这帮助肠管的区域 化。这通过多种分泌因子诸如？6?、1拉、16?-8、视黄酸（狀）和81^配体及其拮抗剂来完成。 例如，FGF4和BMP促进预定的后肠内胚层中的Cdx2表达并阻遏前基因 Hhex和S0X2的表 达（2000 Development, 127:1563 - 1567)。WNT信号传导也已显示与FGF信号传导平行工 作，以促进后肠发育并抑制前肠命运（2007 Development, 134:2207 - 2217)。最后，由间充 质分泌的视黄酸调节前肠-后肠边界（2002 Curr Biol, 12:1215 - 1220)。 特异性转录因子的表达水平可用于指定组织的身份。在定形内胚层转化成原肠管 的过程中，肠管变得区域化成广泛域，所述广泛域可通过限制性基因表达模式在分子水平 上进行观察。例如，肠管中区域化的胰腺域显示I3DX-I的极高表达以及⑶X2和S0X2的极 低表达。相似地，高水平的Foxel的存在指示食道组织；在肺组织中高度表达的是NKX2. 1 ; S0X2/0ddl(0SRl)在胃组织中高度表达；PROXl/Hhex/AFP的表达在肝组织中较高；S0X17 在胆道结构组织中高度表达；PDX1、NKX6. 1/PTfla和NKX2. 2在胰腺组织中高度表达；并且 CDX2的表达在肠组织中高。上文概括摘自Dev Dyn 2009, 238:29 - 42和Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25:221-251。 胰腺的形成起于定形内胚层分化成胰腺内胚层（2009 Annu Rev Cell Dev Biol，25:221-251;2009 Dev Dyn，238:29-42)。背侧和腹侧胰腺域产生自前肠上皮。前肠 也产生食道、气管、肺、甲状腺、胃、肝、胰腺和胆管系统。 胰腺内胚层的细胞表达胰-十二指肠同源盒基因 roxi。在不存在Pdxi时，胰腺形 成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，Pdxl表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。 除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织产 生自胰腺内胚层的分化。 D' Amour等人描述了在高浓度激活素和低血清的存在下，产生人胚胎干细胞（ES) 衍生出的定形内胚层的富集培养物（Nature Biotechnol 2005,23:1534-1541;美国专利 7, 704, 738)。将这些细胞移植在小鼠的肾包膜下导致分化成具有内胚层组织特征的更成熟 的细胞（美国专利7, 704, 738)。在添加 FGF-IO和视黄酸后，人胚胎干细胞衍生出的定形内 胚层细胞还可进一步分化成I3DXl阳性细胞（美国专利公开2005/0266554A1)。这些胰腺前 体细胞在免疫缺陷小鼠的脂肪垫中的后续移植导致在3-4个月成熟期后形成功能胰腺内 分泌细胞（美国专利7, 993, 920和美国专利7, 534, 608)。 Fisk等人报道用于由人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统（美国专利7, 033, 831)。 在这种情况下，分化途径分成三个阶段。人胚胎干细胞首先使用丁酸钠和激活素 A的组合 而分化成内胚层（美国专利7,326,572)。然后将细胞和与￡6?或0细胞素〇3的&(^11111111) 结合的BMP拮抗剂诸如头蛋白（Noggin) -起培养，以生成H)X1阳性细胞。通过烟酰胺诱 导终末分化。 小分子抑制剂也已用于诱导胰腺内分泌前体细胞。例如，TGF-B受体和BMP受 体的小分子抑制剂（Development 2011，138:861-871 ;Diabetes 2011,60:239-247)已 用于显著提高胰腺内分泌细胞的数目。另外，小分子活化剂也已用于生成定形内胚层 细胞或胰腺前体细胞（Curr Opin Cell Biol 2009,21:727-732 ;Nature Chem Biol 2009,5:258-265)〇 虽然已在由人多能干细胞产生胰腺细胞的方案方面取得重大进步，但仍然需要建 立产生功能性内分泌细胞且尤其是3细胞的方案。在此，我们证实一类肝配蛋白配体和鞘 氨醇-1-磷酸或鞘氨醇受体的激动剂增强了内分泌细胞的产生并加速内分泌激素和内分 泌前体细胞的聚簇。
技术实现思路
在一个实施例中，本专利技术涉及通过在包含肝配蛋白A4或肝配蛋白A3的培养基中 培养胰腺内胚层细胞群来增强胰岛素和NKX6. 1的表达的方法。在一些实施例中，胰腺内胚 层细胞群基本上不表达CDX2或S0X2。在一些实施例中，胰腺内胚层细胞群通过多能细胞的 逐步分化获得。在一些实施例中，多能细胞是人胚胎多能细胞。 在一个实施例中，本专利技术涉及通过在包含激活素 A或激活素 C的培养基中培养胰 腺内胚层细胞来增强生长抑素的表达同时抑制胰岛素、胰高血糖素和生长素释放肽的表达 的方法。在一些实施例中，经激活素 A或激活素 C处理的胰腺内胚层细胞群表达的生长抑 素比未经激活素 A或激活素 C处理的胰腺内胚层细胞群更多。在一些实施例中，与未经激 活素 A或激活素 C处理的胰腺内胚层细胞群中胰岛素的表达相比，胰岛素的表达在经激活 素 A或激活素 C处理的胰腺内胚层细胞群中受到抑制。在一些实施例中，与未经激活素 A或 激活素 C处理的胰腺内胚层细胞群中胰高血糖素的表达相比，经激活素 A或激活素 C处理 的胰腺内胚层细胞群中胰高血糖素的表达受到抑制。在一些实施例中，与未经激活素 A或 激活素 C处理的胰腺内胚层细胞群中生长素释放肽的表达相比，生长素释放肽的表达在经 激活素 A或激活素 C处理的胰腺内胚层细胞群中受到抑制。在一些实施例中，胰腺内胚层 细胞基本上不表达⑶X2或S0X2。在一些实施例中，经激活素 A或激活素 C处理的胰腺内胚 层细胞通过多能细胞的逐步分化获得。在一本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在激素表达细胞中诱导胰岛素表达的方法，所述方法包括将胰腺内胚层细胞与肝配蛋白配体共培养。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.08 US 61/6571601. 一种在激素表达细胞中诱导胰岛素表达的方法，所述方法包括将胰腺内胚层细胞与 肝配蛋白配体共培养。2. 根据权利要求2所述的方法，其中所述胰腺内胚层细胞与所述肝配蛋白配体共培养 也增强了 NKX6. 1的表达。3. 根据权利要求2所述的方法，其中与未经处理的胰腺内胚层细胞中胰岛素和NKX6. 1 的表达相比，所述胰腺内胚层细胞与肝配蛋白配体共培养增强了所述胰腺内胚层细胞中胰 岛素和NKX6. 1的表达。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述胰腺内胚层细胞基本上不表达CDX2或S0X2。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述胰腺内胚层细胞表达约小于10%的CDX2或 SOX2。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述肝配蛋白配体是肝配蛋白A3或 肝配蛋白A4。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述胰腺内胚层细胞通过多能干细胞的逐步分化 获得。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述多能干细胞是人胚胎多能干细胞。9. 通过权利要求1所述的方法制备的胰岛素和NKX6. 1表达细胞。10. -种通过胰腺内胚层细胞与肝配蛋白配体共培养所制备的细胞群，其中与未经肝 配蛋白配体处理的胰腺内胚层细胞相比，所述细胞群表达增强的胰岛素和NKX6. 1。11. 根据权利要求10所述的细胞群，其中所述肝配蛋白配体是肝配蛋白A3或肝配蛋白 A4。12. -种增强激素表达细胞中生长抑素的表达的方法，所述方法包括将胰腺内胚层细 胞培养于包含激活素 A或激活素 C的培养基中。13. 根据权利要求12所述的方法，其中胰岛素、胰高血糖素和生长素释放肽的表达受 到抑制。14. 根据权利要求12所述的方法，其中经激活素 A或激活素 C处理的所述胰腺内胚层 细胞群表达的生长抑素比未经激活素 A或激活素 C处理的胰腺内胚层细胞群更多。15. 根据权利要求14所述的方法，其中与未经激活素 A或激活素 C处理的胰腺内胚层 细胞群中胰岛素的表达相比，胰岛素的表达在经激活素 A或激活素...
【专利技术属性】
技术研发人员：A雷扎尼亚，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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