本发明专利技术提供促进多能干细胞分化为胰岛素产生细胞的方法。具体而言，本发明专利技术提供一种使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3和NKX6.1的表达增加的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供促进多能干细胞分化为胰岛素产生细胞的方法。具体而言，本专利技术提供一种使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3和NKX6. I的表达增加的方法。
技术介绍
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素产生细胞或P细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞例如胚胎干细胞产生功能性P细胞。在脊椎动物的胚胎发育期间，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，如HNF3P、GATA4、MIXL1、CXCR4和S0X17。定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因Pdxl。在不存在Pdxl时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，Pdxl表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。据报道，从小鼠的胚胎细胞体外衍生出了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science (科学)292 =1389,2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似于胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes (糖尿病)49 157, 2000)报道,从小鼠胚胎干细胞衍生的胰岛素分泌细胞在植入链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠时使血糖正常。在一个实例中，Hori等人(PNAS(美国国家科学院院报)99 :16105，2002)公开了用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂(LY294002)处理小鼠胚胎干细胞产生了与P细胞相似的细胞。在另一个实例中，Blyszczuk等人(PNAS(美国国家科学院院报)100 =998,2003)报道了从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞生成产生胰岛素的细胞。Micallef等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成Pdxl阳性胰腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末的期间，加入胚胎干细胞分化第4天的培养物中时视黄酸是诱导PDXl表达最有效的(Diabetes (糖尿病)54 =301,2005)。Miyazaki等人报道了过表达Pdxl的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果表明，外源Pdxl表达明显增强了所得到的分化细胞中胰岛素、促生长素抑制素、葡萄糖激酶、神经元素(neurogenin) 3、p48、Pax6 和 HNF6 白勺表达(Diabetes (糖尿病)53 1030, 2004)。Skoudy等人报道说，活化素A(TGF-P超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(P48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdxl、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用InM活化素A时观察到了最大的效果。他们还观察到胰岛素和Pdxl mRNA的表达水平未受视黄酸影响；然而，3nM FGF7处理导致了 Pdxl转录物的水平增加(Biochem. J.(生物化学月刊)379 :749，2004)。Shiraki等人研究了能特征性增强胚胎干细胞分化成Pdxl阳性细胞的生长因子的效果。他们观察到，TGF-P2可再现地产生更高比例的Pdxl阳性细胞(GenesCells. 2005Jun ；10(6) :503-16.)。Gordon等人阐明了在没有血清存在有激活素连同Wnt信号传导抑制剂存在的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导短尾蛋白(brachyury)[阳性]/HNF3 0 [阳性]内胚层细胞(US2006/0003446A1)。 Gordon等人(PNAS (美国国家科学院院报)，Vol 103，第16806页，2006)声称“Wnt和TGF-P /nodal/激活素信号转导同时为前原条的产生所必需”。然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。Thomson等人从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science (科学)282 :114,1998)。同时，Gearhart和其同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院院报)95 :13726，1998)。与可简单通过与白血病抑制因子(LIF) —起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利No. 6，200，806 ；W0 99/20741 ；W0 01/51616)。D’ Amour等人描述了在高浓度激活蛋白和低血清的存在下产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(Nature Biotechnology (自然.生物技术)2005)。将这些细胞移植到小鼠的肾囊下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟细胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成Pdxl阳性细胞(US2005/0266554A1)。D’Amour等人.(Nature Biotechnology(自然 生物技术)-24,1392-1401 (2006))声称“我们研究出了一种分化方法，其可将人胚胎干(hES)细胞转化成能够合成胰激素胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和葛瑞林(ghrelin)的内分泌细胞。该方法通过引导细胞经过类似于定形内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的阶段转变为表达内分泌激素的细胞来模拟体内胰腺器官发生”。在另一个例子中，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(US2006/0040387A1)。在这种情况下，分化途径分成三个阶段。首先用丁酸钠和活化素A的组合使人胚胎干细胞向内胚层分化。然后将细胞与TGF-P拮抗剂(如成头蛋白(Noggin))结合EGF或P细胞素一起进行培养，以产生Pdxl阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。在一个实例中，Benvenistry等人声称“我们得出结论H)X1的过量表达增强了胰腺富集基因的表达，诱导胰岛素表达可能需要仅在体内存在的附加信号”(Benvenistry等人，Stem Cells (干细胞)2006 ；24 :1923-1930)。在另一个实例中,Grapin-Botton等人声称“Ngn3的早期活化近乎专门地诱导胰高血糖素[阳性]细胞，同时耗尽胰祖细胞库。从Ell. 5开始，PDX-I祖细胞具备了分化成胰岛素[阳性]和PP[阳性]细胞的能力” (Johansson KA等人,Developmental Cell (细胞发育)12，457-465，2007 年 3 月)。NGN3在表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞中的表达可降低细胞进一步分化为胰岛素表达细胞的能力。以前的研究已表明，当经历进一步分化时，表达NGN3的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞更有可能产生胰高血糖素表达细胞，而不是胰岛素表达细胞。然而，NGN3表达对于形成胰腺内分泌细胞或胰腺内分泌前体细胞(可形成例如胰高血糖素表达细胞或胰岛素表达细胞的细胞)是必须的。因此，对NGN3的时间调控对于引导胰腺内分泌前体细胞向胰岛素表达细胞分化本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.23 US 61/2896921.一种使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3和NKX6. I的表达增加的方法，其包括以下步骤 a)培养多能干细胞， b)使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞， c)使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞，以选自 H-9、H-89、GF109203X、HA-1004、PP2、PPU LY294002、渥曼青霉素、SB-203580、SB-202190、酪氨酸磷酸化抑制剂25、酪氨酸磷酸化抑制剂、AG1478、酪氨酸磷酸化抑制剂46、GW5074、Kenpaullo...
【专利技术属性】
技术研发人员：J戴维斯，C帕门特，K迪托尔沃，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：
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