干细胞条件培养基组合物制造技术

本文提供制备条件细胞培养基的方法。所述方法包括：a)将真核细胞培养在具有有效支持细胞生长的组成的生长培养基中；b)将培养细胞与生长培养基分离；和c)将培养细胞维持在具有适于保持细胞存活率但不支持实质性细胞生长的组成的基础培养基中。细胞优选为真皮鞘细胞、真皮乳头细胞或真皮成纤维细胞。所述组合物可用作药物组合物，尤其用于伤口愈合的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】干细胞条件培养基组合物本专利技术涉及用于药学、美容和药用美容(cosmeceutical)应用的组合物,特别是用于包括病变和烧伤的治疗在内的伤口愈合的组合物。干细胞由于其形成多种类型的细胞的能力而在许多治疗、美容和药用美容领域十分引人关注。参见例如EP 0980270。此外，已披露了用于供细胞(包括干细胞)生长的培养基，其因生长细胞将蛋白质和其它因子分泌到培养基中而用于治疗、美容和药用美容应用。参见例如US7, 118. 746、US7, 160，726和W02008/020815。仍然需要鉴定用于治疗、美容和药用美容目的的备选组合物。特别需要鉴定产生不被用于支持干细胞生长的蛋白质性物质污染的条件培养基的方法。此外，可能特别需要鉴定制备条件培养基的有效的可规模化的方法。按照本专利技术的第一个方面，提供包含如下获得的条件细胞培养基的药物组合物 a)将选自真皮鞘细胞、真皮成纤维细胞或真皮乳头细胞的保持干细胞潜能的分化人细胞培养在生长培养基中；和b)将培养基与细胞分离。可用于本专利技术的第一个方面的生长培养基是足以满足细胞生长的培养基。细胞培养方法和培养基为本领域所熟知，包括补充血清的基础培养基、无血清培养基、无蛋白质培养基或化学成分确定的生长培养基。生长培养基通常包含必需氨基酸、糖、盐、维生素、矿物质/无机盐、痕量金属、脂质和核苷，并补充有支持细胞增殖所必需的各种其它组分，例如血清、蛋白质(例如胰岛素、运铁蛋白、生长因子和其它激素)、抗生素(例如庆大霉素、链霉素、青霉素)、附着因子(例如纤连蛋白、胶原、层粘连蛋白)。可组合(例如在血清的情况下)或单独加入补充成分。生长培养基为细胞提供满足特定细胞类型在受控体外环境中生长的营养需要的必需成分。在一个实施方案中，细胞培养过程在一个培养容器中操作，将细胞直接接种到装有微载体的培养容器中，细胞增殖直到达到所需细胞密度。在其它实施方案中，细胞培养过程在至少两个完全不同的细胞培养容器/系统中操作，例如一个或多个种子细胞扩繁容器接着是细胞生产容器。这种多重种子细胞扩繁过程优选利用尺寸递增的培养容器直到得到足够的细胞数目用于最终生产细胞培养容器的接种。种子细胞扩繁培养容器可为相同类型(例如组织培养瓶、摇瓶、滚瓶、转瓶(spinner flask)、wave生物反应器、搅拌爸生物反应器)，但尺寸随种子细胞扩繁进程递增，或者可为随着种子细胞培养扩繁准备妥要转移到生产生物反应器而尺寸递增的混合培养系统(例如组织培养瓶至摇瓶至转瓶至搅拌釜生物反应器系统)。通常控制体外环境以保持最适生长温度、溶解氧、二氧化碳、pH和重量摩尔渗透压浓度。许多细胞培养基配方是领域已知的，或者可容易地获自商用来源。本领域技术人员已知可通过将细胞接种到允许细胞在细胞培养期间生长的生长培养基中来产生条件细胞培养基。在细胞培养结束时或在培养期间的选定点，取出细胞，收获条件培养基。条件培养基可含有许多原始细胞培养生长培养基的成分，但还可含有细胞代谢物和由细胞分泌的其它蛋白质。分泌性蛋白可以是有生物活性的生长因子、细胞因子、蛋白酶和其它胞外蛋白质和肽。在许多实施方案中，本专利技术第一个方面的组合物包含Gro-a、1-309、IL_6、IL_8、IL-13、MIF、PAI-I、SDF-I和TGF- P蛋白的一种或多种，尤其包含TGF- ^ I。按照本专利技术的第二个方面，提供用于制备条件细胞培养基的方法，所述方法包括 a)将真核细胞培养在具有有效支持细胞生长的组成的生长培养基中； b)将培养细胞与生长培养基分离； c)将培养细胞维持在具有适于维持细胞存活率但不支持实质性细胞生长的组成的基础培养基中。可用于本专利技术第二个方面的真核细胞披露于‘Basic Cell Culture’ OxfordUniversity Press (2002) J. M. Davis 主编；以及 ‘Animal Cell Culture’ Oxford University Press (2000) John. R. ff. Masters主编；两份文献通过引用以其整体结合到本文中。术语“干细胞”描述了可产生多种组织类型的细胞的细胞。干细胞是来自胚胎、胎儿或成体的细胞，当与特殊信号转导复合物(其提供成为不同细胞类型的指导)一起出现时，其具有成为不同细胞类型的能力。存在不同类型的干细胞。当精子使卵受精时便形成一个全能细胞，并因此具有形成整个生物体的能力。在受精后头几个小时内，该细胞分裂成相同的全能细胞。受精后大约4天以及几个细胞分裂循环后，这些全能干细胞开始特化。在全能细胞变得更加特化时，因此而被称为“多潜能”。多潜能细胞可分化成体内的每种细胞类型，但不产生胎盘或胎儿发育所必需的支持组织。由于多潜能细胞分化的潜力是不“完整的”，因此这类细胞不能称为“全能”，且它们不是胚胎。多潜能干细胞进行进一步特化成为多能干细胞，所述多能干细胞定向分化成特化用于特殊功能的特定谱系的细胞。多能细胞可分化成存在于其从中衍生的组织中的细胞类型；例如多能(成体)干细胞例如间充质干细胞，例如真皮鞘细胞、真皮乳头细胞和真皮成纤维细胞。细胞可来源于成体、新生儿或胎儿组织，并且可以是自体或同种异体细胞。可采用本领域充分确立的方法对细胞进行遗传修饰。可采用遗传修饰改变分泌到细胞生长条件细胞培养基或条件基础细胞培养基中的一种或多种成分的浓度，例如以增量调节或减量调节蛋白质、引入新的蛋白质、或调节离子浓度。在某些实施方案中，使细胞作为共培养物生长。共培养细胞是生长在一起的两种或更多种不同种类的细胞的混合物。适用于第二个方面的方法的细胞可通过本领域已知方法获得。具体地讲，细胞可从组织中分离、由之前已建立的细胞母液中的细胞扩繁、传代并培养以产生细胞生长条件细胞培养基或条件基础细胞培养基。细胞生长条件细胞培养基或条件基础细胞培养基可使用未分化或分化细胞产生。用于本专利技术第二个方面的方法的细胞优选为保持干细胞潜能的选自真皮鞘细胞、真皮成纤维细胞或真皮乳头细胞的分化人细胞。可用于本专利技术第二个方面的生长培养基如上文有关第一个方面中所述。将细胞培养在生长培养基中，直到达到所需细胞密度。用于本专利技术第二个方面的基础培养基具有适于维持细胞存活率的组成(例如pH和重量摩尔渗透压浓度)以避免细胞溶解但不支持实质性细胞生长、优选不支持细胞生长。基础培养基包含基础组分例如无机盐、氨基酸、维生素和能源(包括糖)，但不补充例如血清、蛋白质、激素和附着因子等成分。优选的能源包含谷氨酰胺。基础培养基在引入培养细胞前无蛋白质，并且在引入培养细胞后不向基础培养基中添加蛋白质补充成分。选择基础培养基的组成以维持培养细胞的存活率以供输出细胞代谢物并分泌到基础培养基中。可使用的基础培养基的实例包括Ames培养基、Eagle基础培养基、Click培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基、Ham养分混合物F-12、Glasgow极限必需培养基、Iscove改良的Dulbecco培养基、Eagle极限必需培养基和RPMI-1640培养基。在本专利技术第二个方面的许多优选实施方案中，在从生长培养基分离后并在引入基础培养基之前洗涤细胞。合适的细胞洗涤溶液的实例为本领域所熟知，包括缓冲液，例如磷酸缓冲盐溶液。在一些优选的实施方案中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.09.18 GB 0916370.01.一种用于制备条件细胞培养基的方法，所述方法包括 a)将真核细胞培养在具有有效支持细胞生长的组成的生长培养基中； b)将培养细胞与生长培养基分离； c)将培养细胞维持在具有适于维持细胞存活率但不支持实质性细胞生长的组成的基础培养基中。2.权利要求I的方法，其中所述细胞为真皮鞘细胞、真皮乳头细胞或真皮成纤维细胞。3.前述权利要求中任一项的方法，其中所述基础培养基在引入培养细胞前不含蛋白质。4.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述细胞附着在微载体上进行培养。5.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述细胞在与生长培养基分离后并且在引入所述基础培养基前进行洗涤。6.前述权利要求中任一项的方法，其中对步骤c)的产物进行随后的下列一种或多种过程 a)部分或完全纯化； b)冷冻； c)冻干；和 d)干燥。7.一种组合物，其通过前述权利要求中任一项的方法产生。8.—种药物组合物，其通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：BV卡拉，
申请(专利权)人：富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司，
类型：发明
国别省市：