制造人源化的非人类哺乳动物的方法技术

在此提供了在一种非人类哺乳动物体内重建功能性人类血细胞谱系的方法，包括将人类造血干细胞(HSC)和编码一种或多种人类细胞因子的核酸引入到一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内。在其中在该非人类哺乳动物体内该核酸被表达并且这些人类HSC分化成多种功能性人类血细胞谱系的条件下维持该非人类哺乳动物，由此在该非人类哺乳动物体内重建功能性人类血细胞谱系。还提供了在一种非人类哺乳动物体内生产出针对一种免疫原的人类抗体的多种方法、分泌这些单克隆抗体的杂交瘤以及由这些B细胞生产的抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体)以及由这些方法生产的非人类哺乳动物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制造人源化的非人类晡乳动物的方法相关申请本申请要求于2009年6月29日提交的美国临时申请号61/221，438的权益。通过引用将以上一项或多项申请的全部传授内容结合在此。
技术介绍
对于以合成的和控制的方式在小型动物模型中研究针对病原体感染的人类免疫应答存在巨大的需求。过去二十年来，已经投入了巨大的努力用人血谱系细胞重新构建缺少T淋巴细胞和B淋巴细胞的重症联合免疫缺陷(SCid)型小鼠(Shultz LD7Ishikawa F，Greiner DL(2007)Nat RevImmunol 7:118-130)。然而，由于在受体小鼠体内移入较差、人类T细胞和B细胞快速消失、或造血细胞恶性肿瘤的快速发展，早期的尝试是不成功的。通过使用不仅缺乏T细胞和B细胞(由于scid突变亦或重组活化基因(Rag)突变)而且缺乏自然杀伤(NK)细胞(由于缺失共同的Y链(Yc或I12rg))的受体小鼠实现了突 破(Hiramatsu H，et al. (2003) Blood 102 :873-880 ；Traggiai E，et al. (2004) Science304 :104-107) ο将人类造血干细胞(HSC)过继性转移到N0D_scid I12rg+(NSG)受体亦或BALB/c-Rag2^I12rg^受体体内导致HSC在受体骨髓(BM)中稳定地、长期地移入并且在外周(人源化小鼠或humice)体内产生全人血谱系细胞(Hiramatsu H, et al. (2003)Blood102 :873-880 ;Traggiai E, et al. (2004)Science 304 :104-107)。现存的人源化小鼠模型提供了用于研究人类病原体感染的一种重要工具(DavisPH, Stanley SL, Jr. (2003)Cell Microbiol 5 :849-860 ；Bente DA, et al. (2005)J Virol79 :13797-13799 ；Islas-Ohlmayer M，et al. (2004) J Virol 78 :13891-13900 ；GuiradoE, et al. (2006)Microbes Infect 8 1252-1259 ；Kneteman NM, et al. (2006) Hepatology43 :1346-1353 Jiang Q, et al. (2008) Blood 112 :2858-2868)(尤其是感染人血谱系细胞的那些)。它们也开始允许在小型动物模型中研究针对病原体的人类免疫应答。然而，目前可用的模型远不是最佳的。例如，在不同的细胞谱系之间人类细胞重建的水平是显著不同的。B细胞的重建是强劲的并且T细胞的重建是适当的，但是这些B细胞和T细胞都是无功能的。此外，NK细胞和髓系细胞的重建通常是较差的或不可检出的。因此，对于人类免疫系统的改进的非人类模型以及制造它们的方法存在巨大的需求。专利技术概述在此所示的是，人类血细胞谱系被人类造血干细胞(HSC)的较差重建的主要是由于在该非人类哺乳动物体内缺乏对于这些细胞谱系的发育和维持所必需的适当的人类细胞因子。当将编码人IL-15和Flt-3/Flk-2配体的质粒DNA递送到人源化小鼠体内时(例如通过流体动力学尾静脉注射)，人类细胞因子的表达持续2至3周，并且诱导出高水平的NK细胞持续一个月以上。细胞因子诱导的NK细胞表达活化和抑制受体两者，在体外杀死靶细胞，并且在体内对病毒性感染强烈地应答。类似地，人类GM-CSF和IL-4、巨噬细胞集落刺激因子、或促红细胞生成素以及IL-3的表达对应地导致树突状细胞、单核细胞/巨噬细胞、或红细胞的重建显著地增强(参见Chen, Q.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 106 21783-21788 (2009))，通过引用将其结合在此。而且，GM-CSF和IL-4增强了人类T细胞以及人类B细胞的重建。因此，使用人类细胞因子基因表达(例如通过流体动力学递送)连同人类HSC—起是用于改善人源化小鼠体内特异性人类血细胞谱系的重建的一种简单且有效的方法，这为在小型动物模型体内针对人类疾病以及它们的进展进行建模以及为针对人类免疫应答进行研究提供了一种重要的工具。因此，在此提供了在非人类哺乳动物体内重建功能性人类血细胞谱系的方法，由此制造出一种人源化的非人类哺乳动物。在具体实施方案中，制造出多种人源化小鼠(humice)。一方面，本专利技术是针对在一种非人类哺乳动物体内重建功能性人类血细胞谱系的方法，该方法包括将多种人类造血干细胞(HSC)以及编码一种或多种人类细胞因子的一种(一种或多种)核酸引入到一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内。在其中在该非人类哺乳动物体内该核酸被表达并且这些人类HSC分化成多种功能性人类血细胞谱系的条件下维持该非人类哺乳动物，由此在该非人类哺乳动物体内重建功能性人类血细胞谱系。在另一方面，本专利技术是针对在一种非人类哺乳动物体内重建功能性人类NK细胞的方法，该方法包括将人类造血干细胞(HSC)和编码一种或多种人类细胞因子的核酸引入到一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内，其中当在该非人类哺乳动物体内表达时这些人类细胞因子促进这些人类HSC分化成功能性人类NK细胞。在其中在该非人类哺乳动物体内该核酸被表达并且这些人类HSC分化成功能性人类NK细胞的条件下维持该非人类哺乳动物，由此增强了在该非人类哺乳动物体内这些人类NK细胞的重建。在又另一方面，本专利技术是针对在一种非人类哺乳动物体内重建功能性人类树突状细胞的方法，该方法包括将人类造血干细胞(HSC)和编码一种或多种人类细胞因子的核酸引入到一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内，其中当在该非人类哺乳动物体内表达时这些人类细胞因子促进这些人类HSC分化成功能性人类树突状细胞。在其中在该非人类哺乳动物体内该核酸被表达并且这些人类HSC分化成功能性人类树突状细胞的条件下维持该非人类哺乳动物，由此增强了在该非人类哺乳动物体内这些功能性人类树突状细胞的重建。在另一方面，本专利技术是针对在一种非人类哺乳动物体内重建功能性人类单核细胞/巨噬细胞的方法，该方法包括将人类HSC和编码一种或多种人类细胞因子的核酸引入到一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内，其中当在该非人类哺乳动物体内表达时这些人类细胞因子促进这些人类HSC分化成功能性人类单核细胞/巨噬细胞。在其中在该非人类哺乳动物体内该核酸被表达并且这些人类HSC分化成多种功能性人类单核细胞/巨噬细胞的条件下维持该非人类哺乳动物，由此在该非人类哺乳动物体内重建功能性人类单核细胞/巨噬细胞。在另一方面，本专利技术是针对在一种非人类哺乳动物体内重建功能性人类红细胞的方法，该方法包括将人类HSC和编码一种或多种人类细胞因子的核酸引入到一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内，其中当在该非人类哺乳动物体内表达时这些人类细胞因子促进这些人类HSC分化成功能性人类红细胞。在其中在该非人类哺乳动物体内该核酸被表达并且这些人类HSC分化成多种功能性人类红细胞的条件下维持该非人类哺乳动物，由此在该非人类哺乳动物体内重建功能性人类红细胞。在另一方面，本专利技术是针对在一种非人类哺乳动物体内重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.06.29 US 61/221,4381.一种在非人类哺乳动物体内重建功能性人类血细胞谱系的方法，包括 a)将人类造血干细胞(HSC)和编码一种或多种人类细胞因子的核酸引入到一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内；并且 b)在其中在该非人类哺乳动物体内该核酸被表达并且这些人类HSC分化成多种功能性人类血细胞谱系的条件下维持该非人类哺乳动物， 由此在该非人类哺乳动物体内重建功能性人类血细胞谱系。2.如权利要求I所述的方法，其中在将HSC引入该非人类哺乳动物体内之后引入编码该一种或多种人类细胞因子的核酸。3.如权利要求I所述的方法，其中编码该一种或多种人类细胞因子的核酸以裸DNA的形式或在一种载体中引入。4.如权利要求3所述的方法,其中该载体是一种质粒、一种病毒载体、或它们的一种组口 ο5.如权利要求4所述的方法,其中该病毒载体是一种慢病毒或一种腺病毒载体。6.如权利要求I所述的方法，其中编码该一种或多种人类细胞因子的核酸以质粒DNA的形式使用流体动力学注射方法引入。7.如权利要求I所述的方法，其中该一种或多种人类细胞因子是选自下组，该组由以下各项组成白细胞介素_12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)、Flt3L(Fms-相关酪氨酸激酶3配体)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-3 (IL-3)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素(EPO)以及它们的一种组入口 ο8.如权利要求I所述的方法，其中该非人类哺乳动物是一个小鼠。9.如权利要求8所述的方法，其中该小鼠是选自下组，该组由以下各项组成一种携带重度联合免疫缺陷突变的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scid小鼠)、一种携带重度联合免疫缺陷突变并且缺少针对细胞因子受体Y链的一种基因的非肥胖糖尿病小鼠(NOD/scidIL2R Y + 小鼠)以及一种 Balb/c rag+ y c+ 小鼠。10.如权利要求I所述的方法，其中被重建的该功能性人类血细胞谱系是功能性人类髓样细胞、功能性人类淋巴样细胞或它们的组合。11.如权利要求10所述的方法，其中这些人类髓样细胞是人类单核细胞、人类巨噬细胞、人类树突状细胞、人类红细胞、以及它们的组合；并且该人类淋巴样细胞是人类NK细胞、人类B细胞、人类T细胞、以及它们的组合。12.如权利要求I所述的方法，其中该一种或多种人类细胞因子是白细胞介素-15(IL-15)以及Fms-相关酪氨酸激酶3配体(Flt3L)，并且在该非人类哺乳动物体内重建的这些功能性血细胞谱系是人类NK细胞。13.如权利要求I所述的方法，其中该一种或多种人类细胞因子是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及白细胞介素4 (IL-4)，并且在该非人类哺乳动物体内重建的这些功能性血细胞谱系是人类树突状细胞。14.如权利要求I所述的方法，其中该一种或多种细胞因子是巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)，并且在该非人类哺乳动物体内重建的这些功能性血细胞谱系是人类单核细胞/巨噬细胞。15.如权利要求I所述的方法，其中该一种或多种细胞因子是促红细胞生成素(EPO)以及白细胞介素3 (IL-3)，并且在该非人类哺乳动物体内重建的这些功能性血细胞谱系是人类红细胞。16.一种在非人类哺乳动物体内重建功能性人类NK细胞的方法，包括 a)将人类造血干细胞(HSC)和编码一种或多种人类细胞因子的核酸引入一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内，其中当表达于该非人类哺乳动物体内时，这些人类细胞因子促进人类HSC分化成功能性人类NK细胞；并且 b)在其中在该非人类哺乳动物体内该核酸被表达并且这些人类HSC分化成多种功能性人类NK细胞的条件下维持该非人类哺乳动物， 由此增强了该非人类哺乳动物体内人类NK细胞的重建。17.如权利要求16所述的方法，其中该核酸编码人类IL-15以及人类Flt-3/Flk-2配体。18.如权利要求17所述的方法，其中该非人类哺乳动物的外周血中约5%至约21%的白细胞是人类NK细胞。19.如权利要求18所述的方法，其中在该非人类哺乳动物体内将人类NK细胞的表达维持约30天。20.一种在非人类哺乳动物体内重建功能性人类树突状细胞的方法，包括 a)将人类造血干细胞(HSC)和编码一种或多种人类细胞因子的核酸引入一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内，其中当表达于该非人类哺乳动物体内时，这些人类细胞因子促进人类HSC分化成功能性人类树突状细胞；并且 b)在其中在该非人类哺乳动物体内该核酸被表达并且这些人类HSC分化成多种功能性人类树突状细胞的条件下维持该非人类哺乳动物， 由此增强了该非人类哺乳动物体内功能性人类树突状细胞的重建。21.如权利要求20所述的方法，其中该核酸编码人类GM-CSF以及人类IL-4。22.如权利要求21所述的方法，其中进一步包括引入编码人类Flt-3/Flk-2配体的核酸。23.一种在非人类哺乳动物体内重建功能性人类单核细胞/巨噬细胞的方法，包括 a)将人类造血干细胞(HSC)和编码一种或多种人类细胞因子的核酸引入一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内，其中当表达于该非人类哺乳动物体内时，这些人类细胞因子促进人类HSC分化成功能性人类单核细胞/巨噬细胞；并且 b)在其中在该非人类哺乳动物体内该核酸被表达并且这些人类HSC分化成多种功能性人类单核细胞/巨噬细胞的条件下维持该非人类哺乳动物， 由此增强了该非人类哺乳动物体内功能性人类单核细胞/巨噬细胞的重建。24.如权利要求23所述的方法，其中该核酸编码人类巨噬细胞集落刺激因子。25.—种在非人类哺乳动物体内重建功能性人类红细胞的方法，包括 a)将人类造血干细胞(HSC)和编码一种或多种人类细胞因子的核酸引入一种免疫缺陷型非人类哺乳动物体内，其中当表达于该非人类哺乳动物体内时，这些人类细胞因子促进人类HSC分化成功能性人类红细胞；并且 b)在其中在该非人类哺乳动物体内该核酸被表达并且这些人类HSC分化成多种功能性人类红细胞的条件下维持该非人类哺乳动物， 由此增强了该非人类哺乳动物体内功能性人类红细胞的重建。26.如权利要求25所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈清风，陈建竹，
申请(专利权)人：麻省理工学院，
类型：发明
国别省市：