人胚胎干细胞的分化制造技术

本发明专利技术提供一种促进多能干细胞分化为胰岛素生成细胞的方法。具体而言，本发明专利技术提供一种产生表达胰内分泌谱系特征性标志物并共表达NKX6.1和胰岛素以及极微量的胰高血糖素的细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供促进多能干细胞分化为胰岛素生成细胞的方法。具体而言，本专利技术提供一种方法，其产生表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞，所述细胞共表达NKX6. I和胰岛素以及极微量的胰高血糖素。
技术介绍
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏，已使人们的注意力集中在开发适于移入的胰岛素生成细胞或P细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞例如胚胎干细胞产生功能性P细胞。在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，如HNF3P、GATA4、MIXLl、CXCR4和S0X17。定形内胚层分化成胰内胚层导致形成胰腺。胰内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因roxi。在不存在roxi时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，PDXi表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了含有其他细胞类型，成熟的胰腺还含有外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰内胚层的分化。据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生出了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science 292 =1389,2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似于胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes 49 =157,2000)报道，小鼠胚胎干细胞衍生的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠血糖恢复正常。在一个实例中，Hori等人(PNAS 99 :16105，2002)公开了用磷酸肌醇3-激酶抑制剂(LY294002)处理小鼠胚胎干细胞产生了与P细胞相似的细胞。又如，Blyszczuk等人(PNAS 100 =998,2003)报道了从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞产生产胰岛素的细胞。Micallef等人报道，视黄酸可以调控胚胎干细胞定向形成roXl阳性胰内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末期的期间，当将视黄酸加入胚胎干细胞分化第4天的培养物时，其最有效地诱导Pdxl表达(Diabetes 54:301,2005)。Miyazaki等人报道了过量表达Pdxl的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果表明，外源Pdxl表达明显增强了所得到的分化细胞中胰岛素、促生长素抑制素、葡萄糖激酶、神经元素(neurogenin) 3、p48、Pax6 和 Hnf6 基因的表达(Diabetes 53:1030,2004)。Skoudy等人报道，激活蛋白ACTGF-P超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(P48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdxl、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用InM激活蛋白A时观察到了最大的效果。他们还观察到胰岛素和PdxlmRNA的表达水平不受视黄酸影响；然而，3nM FGF7处理导致了 Pdxl转录物的水平增加(Biochem. J. 379 749，2004)。Shiraki等人研究了能特异性增强胚胎干细胞分化成Pdxl阳性细胞的生长因子的作用。他们观察到，TGF-P 2可再现地产生了更高比例的Pdxl阳性细胞(GenesCells. 2005Jun ；10(6) :503-16.)。Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活蛋白连同Wnt信号转导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury /HNF3 0 内胚层细胞(US2006/0003446A1)。Gordon 等人(PNAS，第 103 卷，第 16806 页，2006 年)声称“Wnt 和 TGF-P /nodal/激活蛋白信号转导同时为前原条的产生所必需”。然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中 的发育程序。Thomson等人从人胚泡分离出了胚胎干细胞(Science 282:114,1998)。同时，Gearhart及同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726,1998)。与可简单通过与白血病抑制因子(LIF) —起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须在非常特殊的条件下维持(美国专利 No. 6，200，806 ；W099/20741 ；W0 01/51616)。D’Amour等人描述了在高浓度激活蛋白和低血清的存在下产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(Nature Biotechnology 2005)。将这些细胞移植到小鼠的肾包膜下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟细胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成Pdxl阳性细胞(US 2005/0266554A1)。D’ Amour 等人(Nature Biotechnology-24,1392-1401 (2006))声称“我们已经开发了一种分化方法，其将人胚胎干(hES)细胞转化成能够合成胰激素胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和生长素释放肽的内分泌细胞。该方法通过引导细胞经过通向表达内分泌激素的细胞的类似定形内胚层、肠管内胚层、胰内胚层和内分泌前体的各阶段，来模拟体内胰腺器官发生”。又如，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(US2006/0040387A1)。在这种情况下，分化途径分成三个阶段。首先用丁酸钠和激活蛋白A的组合使人胚胎干细胞向内胚层分化。然后将细胞与TGF-P拮抗剂(如成头蛋白(Noggin))结合EGF或P细胞素一起进行培养，以产生Pdxl阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。在一个实例中，Benvenistry等人声称“我们得出结论PDX1的过量表达增强了胰腺丰富基因的表达，胰岛素表达的诱导可能需要仅在体内存在的额外信号” (Benvenistry 等人，Stem Cells 2006 ；24 :1923-1930)。在另一个实例中,Grapin-Botton等人声称“Ngn3的早期活化几乎专门诱导了胰高血糖素+细胞，同时耗尽胰腺祖细胞的库。从Ell. 5开始，PDX-I祖细胞具备了分化成胰岛素和PP细胞的能力” (Johansson KA等人，Developmental Cell 12,457-465,2007 年 3 月)。例如，Diez等人声称；“在9和10周，大部分胰高血糖素阳性细胞共表达了胰岛素，尽管在这些阶段可清楚检测到独特的仅表达胰岛素的细胞。在整个研究期间(9至21周)观察到共表达胰岛素和胰高血糖素的细胞，但是它们仅代表全部的表达胰岛素和胰高血糖素的细胞的一小部分”(J Histochem Cytochem. 2009S印；57 (9) :811-24. 2009Apr13)。在一个实例中，Chen等人声称“(_) -indolactam V 能活化蛋白激酶C信号转导并且指导已经定型成内胚层谱系的hESC的胰特化ILV和视黄酸通过相关的机制发挥作用ILV显示出比视黄酸更 强烈地诱导rox-i表达细胞(表达rox-i的细胞的百分数)”(Nature Chemical Biolog本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J徐，
申请(专利权)人：森托科尔奥索生物科技公司，
类型：发明
国别省市：