一种胚胎干细胞的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种胚胎干细胞的培养方法，解决短时间内获得一定量胚胎干细胞的问题。技术方案主要为对脐带组织消毒清洗、切块冻存、复苏风干，最后进行培养，培养过程中，培养皿一号进行5次重复取出第一代细胞系以及补入适量间充质干细胞培养基继续培养的操作；同时对步骤S8及其之后的第一代细胞系所在培养皿内的第二代细胞系进行离心处理获得第二代细胞系纯净体，本发明专利技术的培养方法可以在短时间内培养出多量的含有杂质较少、较为纯净的胚胎干细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养
，特别涉及一种胚胎干细胞的培养方法。
技术介绍
胚胎干细胞是早期胚胎分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，胚胎干细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型，干细胞培养是一个连续的过程，一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化，而其需求时间是不确定性的，因此制备过程中及时进行冻存十分必要。传统的间充质干细胞的制备包括脐带的采集、运输、分离、原代培养和传代培养、冷冻保存和复苏。例如公开号为CN101974484A的专利申请公开了一种人脐带间充质干细胞的制备方法，主要包括脐带的采集、脐带的运输、脐带的交接、脐带的分离、组织块的冻存、组织块的复苏、原代培养和传代培养，所用到的冻存保护液包括基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂，所述脐带冻存保护液中的基础液包括培养液DMEM/F12、磷酸盐缓冲液PBS、生理盐水、含10％胎牛血清的培养液DMEM/F1。以下提出另一种胚胎干细胞的培养方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种胚胎干细胞的培养方法，短时间内培养出多量的含有杂质较少、较为纯净的胚胎干细胞。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种胚胎干细胞的培养方法，包括以下步骤：步骤S1，使用消毒液对脐带组织进行消毒，消毒后使用缓冲溶液进行清洗；步骤S2，将步骤S1的脐带组织剪成组织块；步骤S3，对步骤S2的脐带组织块放入冻存液中在1～7℃环境下冻存1～3d；步骤S4，将步骤S3的脐带组织块进行解冻处理，取出后使用间充质干细胞培养基清洗，实现脐带组织复苏；步骤S5，将步骤S4的脐带组织块平铺于培养皿一号中风干10～25min；步骤S6，向S5中的培养皿一号内加入间充质干细胞培养基并浸没过脐带组织块，并将培养皿一号放入含5％CO2的培养箱中在箱内温度为37℃下进行培养5～7d后得到第一代细胞系；步骤S7，将混有第一代细胞系的间充质干细胞培养基吸出，放入培养皿二号中加入适量间充质干细胞培养基培养2～3d后得到第二代细胞系；同时在脐带组织块所在培养皿中补入适量间充质干细胞培养基继续培养；步骤S8，将步骤S7中培养皿一号产生的第一代细胞系放入培养皿三号中加入间充质干细胞培养基继续培养第二代细胞系，并向培养皿一号中补入适量间充质干细胞培养基继续养；同时对培养皿二号中产生的第二代细胞系进行离心处理获得第二代细胞系纯净体；步骤S9，将步骤S8中培养皿一号进行5次重复取出第一代细胞系以及补入适量间充质干细胞培养基继续培养的操作；同时对步骤S8及其之后的第一代细胞系所在培养皿内的第二代细胞系进行离心处理获得第二代细胞系纯净体。通过上述技术方案，步骤S1中对脐带组织进行清洗能够去除减少干扰培养干细胞的红细胞；步骤S2中剪成一定大小的快状为了增大在单位质量内脐带组织的培养面积，提高培养出第一代细胞系的数量；S3中用于对脐带组织的保存，步骤S4和步骤S5中对脐带组织复苏后准备培养；步骤S6中脐带组织在37℃的环境条件下，能够实现细胞分裂出第一代细胞系，第一代细胞系可以通过肉眼观察到；步骤S7中采用吸管可以将第一代细胞系从脐带组织中分离出，进行再次培养可以得到第二代细胞系，同时本专利技术在培养皿一号中补入适量的，实现原脐带组织继续第一代细胞系，进而提供干细胞的培养速率；步骤S8中，去除肉眼可以观察到的第一代细胞系，对含有肉眼不可见的第二代细胞系和间充质培养基的混合液体放入离心管中在离心机离心操作能够获得第二代细胞单体群，这里第二代细胞单体群指的是除去间充质培养基等杂质的第二代细胞系；通过步骤S9对原脐带组织的重复第五次使用培养能够快速获得第二代细胞系。本专利技术进一步的：所述步骤S3中，冻存液中包含现配的70重量份白蛋白和8重量份DMSO。通过上述技术方案，该浓度下DMSO难以裂解而释放出有害物质造成损坏脐带组织；同时在冻存降温过程中实现单位时间内冻存速率低，能够提高脐带组织的完整性，有利于解冻后脐带组织的存活率。本专利技术进一步的：所述步骤S3中，冻存液的冻存环境温度为1～4℃。通过上述技术方案，该冻存温度下，DMSO难以裂解而释放出有害物质造成损坏脐带组织，提高解冻后脐带组织的存活率。本专利技术进一步的：所述步骤S7中，培养皿二号中设有细胞过滤膜，第一代细胞系设置于细胞过滤膜的上方，间充质干细胞培养基浸没过第一代细胞系。通过上述技术方案，设置细胞过滤膜后，难以通过肉眼观察的个体较小的第二代细胞系能够透过细胞过滤膜，而可以通过肉眼观察的个体较大的第一代细胞就会被细胞过滤膜过滤在其上方，难以进入到细胞过滤膜下方的的间充质培养基中，所以在使用吸管吸取细胞过滤膜下方的间充质培养基进行离心操作后，下层的第二代细胞系含量增多，能够提高分离效果。本专利技术进一步的：所述步骤S7中，向细胞过滤膜与培养皿二号之间补入2～3ml新鲜间充质培养基。通过上述技术方案，实现诱导第二代细胞系穿过细胞过滤膜摄取新鲜的间充质培养基，达到第二代细胞系集中分布在细胞过滤膜下方的间充质培养基中，因此可采用吸管将混有第二代细胞系的间充质培养基混合液体吸出进行离心操作，提高第二代细胞系和第一代细胞系的分离程度。本专利技术进一步的：所述步骤S9中，5次取出的每一代第一代细胞系第五次培养第二代细胞系后，采用细胞培养过滤器将第一代细胞系滤过，并使用间充质培养基润洗细胞过滤膜，再使用离心机对含有第二代细胞系的间充质培养基的混合液体进行离心处理。通过上述技术方案，由于第一代细胞系个体大，可以通过细胞培养过滤器将其分离出，所以使用离心机对含有第二代细胞系的间充质培养基的混合液体进行离心处理后，下层的第二代细胞系中难以再含有第一代细胞系，提高第二代细胞系的被分离程度。综上所述，本专利技术与现有技术具有的优点为：本专利技术中的脐带细胞陆续培养出多组第一代细胞系，并通过各组第一代细胞系分别培养第二代细胞系，实现了能够在短期内获得一定数量的第二代细胞系，同时该第二代细胞系的纯净度高和存活率高；通过细胞过滤膜实现了第一代细胞系和第二代细胞系的预先分离，而第一代细胞系第五次(即最后一次)培养出第二代细胞系后通过采用培养基过滤器除去第一代细胞系收集滤液进行离心操作提高了第二代细胞系的获取量，防止造成得到第二代细胞系随着第一代细胞系的舍去而损失。具体实施方式以下对本专利技术作进一步详细说明。通过制定6个实施例及2个对比例进行试验，并且该8种培养方法进行重复试验五次，针对培养方法进行三个参数表征，参数表征如表格1所示；实施例1～6和对比例1～2的具体操作步骤如下。实施例一，一种胚胎干细胞的培养方法，具体培养步骤如下所示：S1，使用酒精对脐带组织进行消毒，消毒后使用PBS缓冲溶液进行清洗；S2，将步骤S1的脐带组织剪成约为1.5mm*1.5mm大小的脐带组织块；S3，对步骤S2的脐带组织块若干放入现配的含有70重量份白蛋白和8重量份DMSO的冻存液中在4℃环境下冻存2d；S4，将步骤S3的脐带组织块进行解冻处理，取出后使用间充质干细胞培养基清洗，实现脐带组织复苏；S5，将步骤S4的脐带组织块平铺于10cm的培养皿一号中风干10～25min；S6，向S5中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胚胎干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1，使用消毒液对脐带组织进行消毒，消毒后使用缓冲溶液进行清洗；步骤S2，将步骤S1的脐带组织剪成组织块；步骤S3，对步骤S2的脐带组织块放入冻存液中在1~7℃环境下冻存1~3d；步骤S4，将步骤S3的脐带组织块进行解冻处理，取出后使用间充质干细胞培养基清洗，实现脐带组织复苏；步骤S5，将步骤S4的脐带组织块平铺于培养皿一号中风干10~25min；步骤S6，向S5中的培养皿一号内加入间充质干细胞培养基并浸没过脐带组织块，并将培养皿一号放入含5%CO2的培养箱中在箱内温度为37℃下进行培养5~7d后得到第一代细胞系；步骤S7，将混有第一代细胞系的间充质干细胞培养基吸出，放入培养皿二号中加入适量间充质干细胞培养基培养2~3d后得到第二代细胞系；同时在脐带组织块所在培养皿中补入适量间充质干细胞培养基继续培养；步骤S8，将步骤S7中培养皿一号产生的第一代细胞系放入培养皿三号中加入间充质干细胞培养基继续培养第二代细胞系，并向培养皿一号中补入适量间充质干细胞培养基继续养；同时对培养皿二号中产生的第二代细胞系进行离心处理获得第二代细胞系纯净体；步骤S9，将步骤S8中培养皿一号进行5次重复取出第一代细胞系以及补入适量间充质干细胞培养基继续培养的操作；同时对步骤S8及其之后的第一代细胞系所在培养皿内的第二代细胞系进行离心处理获得第二代细胞系纯净体。...

【技术特征摘要】
1.一种胚胎干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1，使用消毒液对脐带组织进行消毒，消毒后使用缓冲溶液进行清洗；步骤S2，将步骤S1的脐带组织剪成组织块；步骤S3，对步骤S2的脐带组织块放入冻存液中在1~7℃环境下冻存1~3d；步骤S4，将步骤S3的脐带组织块进行解冻处理，取出后使用间充质干细胞培养基清洗，实现脐带组织复苏；步骤S5，将步骤S4的脐带组织块平铺于培养皿一号中风干10~25min；步骤S6，向S5中的培养皿一号内加入间充质干细胞培养基并浸没过脐带组织块，并将培养皿一号放入含5%CO2的培养箱中在箱内温度为37℃下进行培养5~7d后得到第一代细胞系；步骤S7，将混有第一代细胞系的间充质干细胞培养基吸出，放入培养皿二号中加入适量间充质干细胞培养基培养2~3d后得到第二代细胞系；同时在脐带组织块所在培养皿中补入适量间充质干细胞培养基继续培养；步骤S8，将步骤S7中培养皿一号产生的第一代细胞系放入培养皿三号中加入间充质干细胞培养基继续培养第二代细胞系，并向培养皿一号中补入适量间充质干细胞培养基继续养；同时对培养皿二号中产生的第二代细胞系进行离心处理获得第二代细胞系纯净体；步骤S9，将步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈继冰，吴振化，
申请(专利权)人：浙江译美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33