包含WNT信号转导途径活化剂的用于诱导视网膜祖细胞分化成为视网膜细胞或用于诱导视网膜细胞增殖的组合物制造技术

公开了用于诱导视网膜细胞增殖或视网膜祖细胞分化成为视网膜细胞的组合物。与胚胎发生期间体内的发育条件相似，所述组合物在无需其它基因转移的情况下就能诱导干细胞在短期内以高产量分化成为多个感光细胞。此外，分化的感光细胞可用于细胞疗法，因为被植入入退化或受损的视网膜中时，它们能植入并融合入视网膜中，从而预防或治愈视网膜退化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于诱导视网膜细胞增殖以及视网膜祖细胞分化成为视网膜细胞的组合物。更具体而言，本专利技术涉及包含fct信号转导途径活化剂的用于诱导视网膜祖细胞分化成为视网膜细胞(尤其是感光细胞)以及用于诱导感光细胞增殖的组合物。
技术介绍
失明是由于生理学或神经学原因而丧失视觉感知的医学病症。数以千万计的人(占世界人口的0. 2-0. 5%)受到失明的影响，并且在个人、社会和经济方面正遭受巨大的损失。视网膜光受体退化是先天或通过其它多种因素引起的失明的更占主导地位的病因之一，包括视网膜发育异常、视网膜退化、老年黄斑退化、糖尿病视网膜病变、视网膜色素变性、先天性视网膜失养症、Leber先天性黑朦、视网膜脱落、青光眼、视神经病变和外伤。迄 今还没有开发出用于对这类疾病进行基础治疗的药物。到目前为止，用新的感光细胞替换这些视网膜疾病的a型和Co型异常感光细胞被认为是唯一有前景的疗法。感光细胞植入被认为通过延迟或抑制视网膜退化、再生退化的视网膜以及增强视网膜功能来预防失明或恢复有缺陷的视力。干细胞已经成为用于视网膜疾病的细胞疗法的有用备选者，所述干细胞包括骨髓干细胞(BMSC)、脐带血干细胞、羊水干细胞、脂肪干细胞、视网膜干细胞(RSC)、胚胎干细胞(ESC)、诱导型多能干细胞(iPSC)和体细胞核移植细胞(SCNT)。对于干细胞分化成为视网膜细胞(尤其是感光细胞)以及基于此的细胞疗法还没有得出有意义的研究结果。这些干细胞向视网膜细胞的分化可使以下几点成为可能1)保证了用于有效细胞疗法的无限细胞来源，2)识别尚不清楚的由胚胎细胞和视网膜前体细胞成为视网膜细胞的分化机制，3)发现视网膜分化相关基因和分子及其损伤疗法，4)理解视网膜退化性疾病的发病机理，以及5)开发用于预防视网膜退化和保护视网膜的药物。自从其首次确立，人胚胎干细胞系就被认为具有分化成为可用于多种疾病的细胞 疗法的有用的各种类型细胞的能力。当人胚胎干细胞允许在临床治疗中精确检查发病机理并提供能够替代异常细胞的新鲜细胞时，其似乎具有高潜能。在完全确定的可再生条件下产生人ESC来源的视网膜感光细胞及其在植入法中的用途保证了其是用于视网膜感光细胞相关疾病的极其有力可能且有效的疗法。假设人ESC来源的细胞与通过正常分化过程所形成的细胞具有相同的性质和功能。基于这种假设，以与产生以下细胞的发育阶段相似的条件下诱导分化表达胰激素的内分泌细胞(D’Amour, et al.，Nat. Biotechnol.，2006 ；24:1392-401)、神经元(Pankratz，et al. , Stem Cells 2007;25:1511-20)、肌细胞(Barberi et al. , Nat. Med. , 2007 ; 13:642-8)和血管内皮细胞(Wang, et al. , Nat.Biotechnol. , 2007 ;25:317-8)。并且，已经进行多次尝试来将人类ESC分化成为可有效用于治疗视网膜疾病的感光细胞，但是大多数情况都以失败告终。实际上，从人胚胎干细胞分化成为视网膜祖细胞是在该领域内迄今为止所作出的最大成就，但是从视网膜祖细胞分化成为感光细胞却失败了(分化率低于0. 01%) (Lambaet al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006 ; 103:12769-74)。一项报道称，人胚胎干细胞被成功诱导分化成为感光细胞，但是其中所用的方法对于分化总共需要超过200天，而其中的分化率低至8%,因此不可能用于临床治疗失明(Osakada et al. , Nat. Biotechnol. , 2008 ；26:215-24)。Wnt信号转导途径参与调节胚胎发生期间的多个过程，包括组织发育、细胞增殖、形态、运动性以及细胞命运决定等(Wodarz & Nusse, Annu. Rev. Cell Dev.Biol.，1998; 14:59-88)。已知促进或调节分化取决于组织类型和分化水平。至今，在胚胎发育和细胞生物学的背景下，已报道fct信号转导途径包括Wnt3a密切参与细胞分化的调节和未分化细胞的维持和增殖(Aubert, et al.，Nat. Biotechnol.，2002; 20:1240-5)。现有技术尚未报道fct信号转导途径对与脊椎动物眼模式发生和神经发生相关的细胞分化和 成熟的影响
技术实现思路
技术问题由本专利技术人利用化学限定的方法对人ESC向视网膜细胞，尤其是感光细胞分化进行广泛且深入的研究，产生了本专利技术，导致以下发现当应用与体内条件相似的用于分化成为感光细胞的体外条件(其中利用分化相关因子及其抑制剂)时，fct信号转导途径活化剂在视网膜细胞增殖以及使干细胞向视网膜细胞(尤其是感光细胞)分化并成熟中起重要作用。技术方案因此，本专利技术的目的是提供包含Wnt信号转导途径活化剂的用于诱导视网膜细胞增殖的组合物。本专利技术的另一目的是提供包含Wnt信号转导途径活化剂的用于诱导视网膜祖细胞分化成为视网膜细胞(尤其是感光细胞)的组合物。有益效果如上文所述，本专利技术的组合物允许干细胞在无需其它基因转移的情况下在短期内以高产量分化成为大量感光细胞。本专利技术的组合物既不需要通过流式细胞术分离感光细胞也无需额外的感光细胞增殖，就能够以高产量产生大量感光细胞，以便分化的感光细胞可容易地被植入退化或受损的视网膜中。此外，分化的感光细胞可用于细胞疗法，因为被植入退化或受损的视网膜中时，这些分化的感光细胞能够在视网膜内植入并融合，从而预防或治愈视网膜退化。附图简要说明图I是细胞形态的显微镜照片(A)左图，来自第28代的细胞在培养5天之后，处于未分化状态的hESC的典型细胞絮凝物(第29代；40X放大倍数)。通过与邻近的MEF饲养细胞明确分离来表征。具有光滑的表面和均匀的形态。(A)右图，从图IA左图的hESC絮凝物分离之后，在超低吸附平板培养4天的悬浮聚集物(40X放大倍数)。球形形态，每个悬浮聚集物由大约292±53个细胞组成。(B)-(D).分化成为视网膜细胞的细胞形态的显微镜照片。(B).诱导分化后第14天，即在悬浮聚集物被转移至聚D赖氨酸/层粘连蛋白包被的平板并在其中培养10天的细胞，其为诱导未分化的hESC分化后的第14天。观察到细胞从悬浮聚集物分离并经历分化。分化早期的细胞形态具有较少的细胞质和既圆又大的细胞核。(C).诱导分化后第19天的细胞，即未分化的hESC在诱导分化19天后的细胞。这些细胞分化成为视网膜祖细胞，并伴随活性增殖。活性增殖和分化状态下的细胞絮凝物形成漩涡排列或玫瑰样结构。(D).诱导分化后第21天的细胞，显示出由活性增殖导致的细胞数量的增加。这些细胞变得更富含细胞质，且它们的细胞核大小比图IC中进行分化的细胞的细胞核更小。这些细胞似乎起对光响应的作用。(E)-(H).诱导分化后第29天的细胞絮凝物的各种形态。 (E).大多数细胞，尤其是在细胞密集区所观察到的细胞的形态。随着分化的进行，与诱导后第21天的细胞相比，细胞显示出相同的细胞结构，但具有更丰富的细胞质和更小且更致密的细胞核。(F).细胞稀少区的细胞的形态。细胞絮凝物表现出方向性并向依赖于细胞簇的某个点移动。观察到更丰富的向两端聚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.10.06 KR 10-2009-0094854;2009.11.26 KR 10-2001.用于诱导视网膜细胞增殖的组合物，其包含fct信号转导途径活化剂。2.如权利要求I所述的组合物，其中所述视网膜细胞是感光细胞。3.如权利要求I所述的组合物，其中所述视网膜细胞是人来源的细胞。4.如权利要求I至3中任一项所述的组合物，其中所述Wnt信号转导途径活化剂选自WntK Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wntl0a、Wntl0b、Wntll、Wntl6b ;增加 β -连环蛋白表达水平的物质；Axin 抑制剂；APC(腺瘤性息肉病)抑制剂；norrin ；R-spondin 2及以上的组合。5.如权利要求4所述的组合物，所述Wnt信号转导途径活化剂选自Wntl、Wnt3a、Wnt5a> WntlI、norrin 及以上的组合。6.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述Wnt信号转导途径活化剂是GSK3 (糖原合酶激酶3)抑制剂。7.如权利要求6所述的组合物，其中所述GSK3抑制剂选自锂(Li)、LiCl、ニ价锌(ニ价 Zn)、BI0(6-溴靛玉红-3’ -肟)、SB216763、SB415286、CHIR99021、QS 11 水合物、TffS119、kenpaullone、alsterpaullone、青定红-3’ -月亏、TDZD-8、Ro 31-8220 甲横酸盐及以上的组合。8.如权利要求7所述的组合物，其中所述GSK3抑制剂选自LiCl、BIO(6-溴靛玉红-3’ -肟)、SB415286及以上的组合。9.如权利要求4所述的组合物，其中在培养基中使用的所述Wnt信号转导途径活化剂的浓度为O. 01至500ng/ml。10.如权利要求9所述的组合物，其中在培养基中使用的所述Wnt信号转导途径活化剂的浓度为I至100ng/ml。11.如权利要求7所述的组合物，其中培养基中使用的除LiCl、BIO和SB415286之外的GSK抑制剂的浓度为O. 01至500ng/ml。12.如权利要求11所述的组合物，其中培养基中使用的除LiCl、BI0和SB415286之外的GSK抑制剂的浓度为I至100ng/ml。13.如权利要求7所述的组合物，其中培养基中使用的LiCl的浓度为O.I至50mM ；BI0的浓度为O. I至50 μ M ;以及SB415286的浓度为O. I至500 μ Μ。14.如权利要求13所述的组合物，其中培养基中使用的LiCl的浓度为I至IOmM；ΒΙ0的浓度为O. 5至5 μ M ;以及SB415286的浓度为5至50 μ Μ。15.用于诱导视网膜祖细胞分化成为视网膜细胞的组合物，其包含fct信号转导途径活化剂。16.如权利要求15所述的组合...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴圣燮，金志妍，
申请(专利权)人：首尔大学校产学协力团，金志妍，
类型：发明
国别省市：