从脐带血产生诱导的多能干细胞制造技术

提供了用于产生和使用基因修正的诱导的多能干细胞的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从脐带血产生诱导的多能干细胞相关申请的交叉引用本申请要求2009年6月19日提交的美国临时申请第61/218，611号的权益，其全部内容在此援弓丨加入，并用于所有目的。
技术介绍
利用整合病毒法使多能性因子和癌基因异位表达足以诱导小鼠和人类成纤维细胞的多能性3_9。然而，该过程缓慢、效率低下，并且载 体被永久整合入基因组限制了 iPS细胞在治疗应用中的使用^进一步的研究证实，老化程度、来源和所用的细胞类型对重新编程效率具有重要影响，最终需要表达较少的因子和/或减少整个过程的时间。最近证实，人类角质细胞的逆转录病毒转导导致重新编程而具有多能性，效率比成纤维细胞高100倍，并且速率比成纤维细胞快2倍。据推测，这些差异是可能是由于起始角质细胞群体中KLF4和c-MYC的内源表达和/或存在未分化的祖细胞库，所述未分化的祖细胞呈现出更易于重新编程的表观遗传状态 ' 小鼠中的其它研究进一步支持后一推测n’12。然而，干细胞通常是稀有的，并且难以大量获取和分离(例如，神经干细胞13’14)。诱导的多能干细胞(iPS)已引起了再生医学的关注，因为其允许体外产生患者特异性的祖细胞，对细胞治疗具有潜在价值^然而，在很多情况下，现成的方法可能是理想的，例如对于急性疾病状态的细胞治疗，或当患者的体细胞由于慢性病或衰老而改变时。脐带血(CB)干细胞正适合于此目的，因为它们是新生的、免疫未成熟的细胞，具有最小的基因和表观遗传学改变，并且通过CB库的世界网络可容易地获得成几十万的免疫分型的CB单位2。CB细胞被认为是能替代骨髓(BM)作为用于造血移植的干细胞来源，并且可以收集足够量的CB细胞而不会为供体带来任何风险15。除了易于获取之外，CB细胞结合了年轻细胞具有最小体细胞突变的性质和新生细胞的免疫学未成熟性所提供的优势15。这些性质允许较宽松的HLA供体-受体选择标准，为移植提供了决定性的益处。此外，脐带血库的世界性综合网络确保能快速且有效地搜索CB干细胞的相容供体2。最后，已证实CB⑶133+干细胞能表达0CT4、S0X2、NAN0G、REX1和其它多能性相关标志物16_18，并因此原则上可能更易于重新编程。本文首次描述了包括以下的实施方案通过4种(OSKM)、3种(OSK)以及少至2种(OS)转录因子的逆转录病毒转导而无需2种强的癌基因(c-MYC和KLF4)或其它化合物，使CB干细胞快速且有效重新编程而具有多能性。利用本文所述的某些方法和组合物，能在非常有效且快速的过程中通过0CT4、S0X2、KLF4和c-MYC的逆转录病毒转导而将CB干细胞重新编程而具有多能性。得到的CB来源的iPS(CBiPS)细胞在表型和分子学上不同于人胚胎干细胞(hES)。此外，无需使用c-MYC和KLF4癌基因并仅通过0CT4和S0X2的过表达即可有效实现脐带血iPS的产生。本文所述的方法和组合物克服了本领域中的问题，并且可以为创建用于现成应用的HLA匹配的CBiPS细胞的综合库奠定基础。专利技术概述本文特别提供了用于从脐带血产生和使用诱导的多能干细胞的高效方法和组合物。一方面，提供了制备诱导的多能干细胞的方法。所述方法包括用编码0CT4蛋白的核酸和编码S0X2蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。另一方面，提供了制备诱导的多能干细胞的方法。所述方法包括用编码0CT4蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。另一方面，提供了按照本文的方法制备的诱导的多能干细胞。一方面，提供了包含编码0CT4蛋白的核酸和编码S0X2蛋白的核酸的脐带血干细胞。 另一方面，提供了包含编码0CT4蛋白的核酸的脐带血干细胞。一方面，提供了产生人类体细胞的方法。所述方法包括使诱导的多能干细胞与细胞生长因子接触。允许所述诱导的多能干细胞进行分裂，从而形成所述人类体细胞。在一些实施方案中，通过包括以下步骤的过程制备所述诱导的多能干细胞用编码0CT4蛋白的核酸和编码S0X2蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。在另一实施方案中，通过包括以下步骤的过程制备所述诱导的多能干细胞用编码0CT4蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。另一方面，提供了治疗需要组织修复的哺乳动物的方法。所述方法包括将诱导的多能干细胞给予所述哺乳动物，并允许所述诱导的多能干细胞进行分裂并分化为所述哺乳动物中的体细胞，从而提供所述哺乳动物的组织修复。在一些实施方案中，通过包括以下步骤的过程制备所述诱导的多能干细胞用编码0CT4蛋白的核酸和编码S0X2蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。在另一实施方案中，通过包括以下步骤的过程制备所述诱导的多能干细胞用编码0CT4蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。附图简要描述附图说明图1A-1E.仅利用0CT4和S0X2因子产生CBiPS细胞系。图IA :脐带血干细胞重新编程的时间线。感染后3天，将CB⑶133+细胞转移到饲养细胞上。在第9天左右观察到小的附着集落。12天后，典型hES样集落清晰可见。图IB :基因组DNA PCR确认插入4个、3个和仅2个转基因。图IC :CBiPS2F-l、3F-10和4F-3细胞系的代表性相差图像和碱性磷酸酶(AP)染色。图ID :CBIPS2F、3F和4F细胞系的代表性端粒酶活性(HI :热失活，HFF :人类包皮成纤维细胞，-C :作为阴性对照的裂解缓冲液，+C :阳性对照和QC :定量对照)。图IE :CBIPS2F-1细胞系的多能性标志物的免疫荧光分析。集落表达胚胎标志物SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81和转录因子0CT4、S0X2和NAN0G。下方的成纤维细胞提供阴性对照。比例尺:250 μ m图2A-2G. CBiPS细胞系的表征。图2A :描述多能性标志物0CT4、S0X2、NANOG,REXl、CRIPTO、KLF4和c_MYC的定量RT-PCR分析的柱状图。分析了 ES [2]和角质细胞iPS(KiPS)细胞系以及来源于新鲜和冷冻样品的不同CBiPS细胞系。误差棒代表三个平行样品的s. d.(标准差)。柱状例(从左至右):CBiPS4F-3、CBiPS4F-5、CBiPS3F_10、CBiPS3F-12、CBiPS2F_l、CBiPS2F_2、CBiPSF-U CBiPSF-5、ES2 和 KiPS0 图 2B :描述定量RT-PCR的柱状图显示了 CBiPS细胞系中0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC转基因的抑制。柱状例(从左至右):CBiPS4F-3、CBiPS3F-10 和 CBiPS2F_l。图 2C :CBiPS2F_l 体外分化为 3个原代胚细胞层(外胚层-Tujl、内胚层-A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.06.19 US 61/218,6111.制备诱导的多能干细胞的方法，包括 (i)用编码0CT4蛋白的核酸和编码S0X2蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞；以及 ( )允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。2.如权利要求I所述的方法，其中不用编码cMYC蛋白、LIN28蛋白、NANOG蛋白或KLF4蛋白的其它核酸转染所述脐带血干细胞。3.制备诱导的多能干细胞的方法，包括 (i)用编码0CT4蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞；以及 ( )允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。4.如权利要求3所述的方法，其中不用编码cMYC蛋白、LIN28蛋白、NANOG蛋白或KLF4蛋白的其它核酸转染所述脐带血干细胞。5.如权利要求I或3所述的方法，其中所述脐带血干细胞表达CD133抗原。6.如权利要求I或3所述的方法，其中所述脐带血干细胞来源于新鲜脐带血。7.如权利要求I或3所述的方法，其中所述脐带血干细胞来源于冷冻脐带血。8.按照权利要求1-7中任一项所述的方法制备的诱导的多能干细胞。9.脐带血干细胞，包含编码0CT4蛋白的核酸和编码S0X2蛋白的核酸。10.如权利要求9所述的脐带血干细胞，其中所述脐带血干细胞基本上由编码0CT4蛋白的核酸和编码S0X2蛋白的核酸组成。11.脐带血干细胞，包含编码0CT4蛋白的核酸。12.如权利要求11所述的脐带血干细胞，其中所述脐带血干细胞基本上由编码0CT4蛋白的核酸组成。13.如权利要求9、10、11或12所述的脐带血干细胞，其中所述脐带血干细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿莱斯桑德拉·吉奥盖帝，胡安·卡洛斯·伊兹皮苏阿贝尔蒙特，
申请(专利权)人：索尔克生物学研究院，西班牙巴塞罗那再生医学中心，
类型：发明
国别省市：