多能干细胞制造技术

本发明专利技术提供了从成体细胞制备多能干细胞的方法。具体地讲，本发明专利技术提供了在不使用饲养细胞层或可增加逆转录病毒转染效率的试剂的情况下从体细胞制备多能干细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了从成体细胞制备多能干细胞的方法。具体地讲，本专利技术提供了在不使用饲养细胞层或可增加逆转录病毒转染效率的试剂的情况下从体细胞制备多能干细胞的方法。
技术介绍
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细 胞(例如胚胎干细胞或从成体细胞产生的多能干细胞)产生功能性β细胞。从成体细胞产生的多能干细胞或“诱导型多能干细胞”或“IPS细胞”是通过诱导某些基因的“强制”表达而以人为方式来源于非多能细胞(例如成体体细胞)的多能干细胞类型。据信，诱导型多能干细胞与天然多能干细胞(如胚胎干细胞)在很多方面都相同，如某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、有活力的嵌合体形成以及潜能和分化能力。在一个例子中，Takahashi等人声称“我们证明了通过在ES细胞培养条件下引入四个因子0ct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4,可从小鼠胚胎或成体成纤维细胞诱导多能干细胞” (Cell 126 :663-676,2006)。又如，Li等人声称“我们揭示了基因重编程和化学条件相结合可产生和维持大鼠iPSC(riPSC)，从而产生畸胎瘤并且大大有助于产生嵌合体大鼠。采用相同的策略也足以产生非典型人iPSC (hiPSCs)，所述非典型人iPSC表现出与mESC类似的集落形态和自我更新要求 / 信号转导响应。”(Cell Stem Cell 4 :16_19，2009)。又如，Maherali等人声称“四个转录因子0ct4、Sox2、c_Myc和Klf4的异位表达足以将多能状态赋予成纤维细胞基因组，从而产生诱导型多能干(iPS)细胞。仍然未知的是，这四个因子诱导的细胞核重编程是否整体重置分化的细胞和多能细胞之间的表观遗传差异。在这里，我们使用新选择方法从成纤维细胞产生iPS细胞，以表征它们的表观遗传状态。雌性iPS细胞显示出体细胞沉默的X染色体的重新激活，并且在分化时经历了随机X失活。两个关键组蛋白修饰的全基因组分析表明iPS细胞与ES细胞高度类似。与这些观察相符的是，iPS细胞可产生有活力的高度嵌合体，并影响生殖细胞系。这些数据表明转录因子诱导的重编程可使体细胞表观基因组整体逆转为类ES状态。”(Cell Stem Cell I 55-70,2007)。又如，Stadtfeld等人声称“我们构建了强力霉素诱导的慢病毒系统，用于在成纤维细胞中瞬时表达四个重编程因子c-Myc、Klf4、0ct4和Sox2。”(Cell Stem Cell 2 230-240)。又如,Nakagawa等人声称“我们在此描述了不需要Myc逆转录病毒的iPS细胞产生的改进方案。我们使用该方案获得的非iPS背景细胞显著减少，并且产生的iPS细胞始终具有高质量。在研究期间，Myc-iPS细胞来源小鼠不形成肿瘤。该方案也能够有效分离iPS细胞而无需药物选择。此外，我们在无MYC的情况下从成体表皮成纤维细胞产生了人iPS 细胞。”(Nature Biotechnology 26 :101-106，2008)。又如，Takahashi等人声称“我们证明了利用同样的四个因子0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，可以从成人表皮成纤维细胞产生iPS细胞。” (Cell 131 :861-872, 2007)。又如，Okita等人声称“我们之前的研究显示通过逆转录病毒引入0ct3/4(也称为Pou5fl)、Sox2、c-Myc和Klf4，并随后对Fbxl5 (也称为Fbxol5)表达进行选择，可从小 鼠成纤维细胞诱导多能干细胞。这些诱导型多能干(iPS)细胞(在下文中称为Fbxl5 iPS细胞)在形态、增殖和畸胎瘤形成方面与胚胎干(ES)细胞类似；然而，就基因表达和DNA甲基化模式而言它们则不同，而且不能制备成体嵌合体。这里我们得出结论，对Nanog表达进行选择可得到具有生殖系嵌合能力的iPS细胞，与Fbxl5 iPS细胞相比，该iPS细胞具有增强的类ES细胞基因表达和DNA甲基化模式。” (Nature 448 :313-317,2007)。又如，Wemig等人声称“成纤维细胞可在缺少c_Myc的情况下通过0ct4、Sox2和Klf4 重编程为多能状态。”(Cell Stem Cell 2 =10-12,2008) 又如，Park等人声称“我们从胎儿、新生儿和成人原代细胞(包括从健康研究受试者的皮肤活检组织分离的表皮成纤维细胞)得到了 iPS细胞。” (Nature 451 =141-146,2008)。又如，Yu等人声称“我们的研究表明，四个因子(0CT4、S0X2、NANOG和LIN28)足以将人体细胞重编程为表现出胚胎干(ES)细胞的基本特性的多能干细胞。”(Science318 :1917-1920,2007)。然而，所述前景并未充分展现，部分由于常规衍生、传代和维持多能状态的源于体细胞的多能干细胞存在困难。体细胞来源多能干细胞的稳定和持续长期培养的一个特殊限制是多能干细胞需要在细胞饲养层上衍生。饲养细胞(通常为有丝分裂失活的成纤维细胞)提供未完全确定的培养组分的来源，所述组分可支持体细胞来源多能干细胞的贴壁、生长和传代。然而，由于饲养细胞中固有的可变因素，饲养层培养物阻碍了培养条件标准化以及体细胞来源多能干细胞的定向分化。因此，通常将体细胞来源多能干细胞从基于饲养层的培养物转换为由细胞外基质蛋白构成的贴附层上的无饲养层培养物，以为了进行充分表征了的和受控制的培养和分化。遗憾的是，在饲养细胞上培养得到的体细胞来源多能干细胞转换为无饲养层体系的过程会使细胞产生应激反应，并且可导致自发分化和/或核型不稳定性。因此，仍然明显地需要产生足够质量的且可扩增以满足当前临床需要的诱导型多能干细胞。本专利技术利用替代方法来产生诱导型多能干细胞，其中多能干细胞由体细胞形成，而无需使用饲养细胞层。
技术实现思路
在一个实施例中，本专利技术提供了在不使用饲养细胞层或可增加病毒转染效率的试剂的情况下从体细胞产生多能干细胞的方法。在备选实施例中，本专利技术提供从羊水来源细胞衍生的多能干细胞群，所用方法不需要使用饲养细胞层或可增加病毒转染效率的试剂。附图说明图I示出了人胚胎干细胞系Hl的细胞和CRL2522细胞系来源多能干细胞的多能性相关基因的表达。图2示出了多能干细胞集落的形态。图A和B示出了衍生自羊水来源细胞的多能干细胞集落的代表性显微图。图C和D示出了衍生自羊水来源细胞(AFD1)、传代五次后的多能干细胞。图E示出了未转导的羊水来源细胞。 图3示出了衍生自羊水来源细胞的多能干细胞的多能性相关基因的表达。图4示出了衍生自羊水来源细胞(AFDl)的多能干细胞的多能性相关基因的表达，其在指定的传代次数通过流式细胞术检测。图5示出了衍生自羊水来源细胞(AFDl)的多能干细胞的多能性相关基因的表达，其在第5次传代时通过免疫荧光检测。图6示出了 CRL2522细胞系来源的多种多能干细胞的多能性相关基因的表达。图7示出了衍生自羊水来源细胞的两个多能干细胞群中定形内胚层谱系特征性标志物的表达。图8示出了 CRL2522细胞系来源的多能干细胞群本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.10.29 US 61/2561491.ー种在不使用饲养细胞层或増加逆转录病毒转染效率的试剂的情况下从...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·冯，B·弗赖尔，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：