用于治疗处理肿瘤疾病的成体干细胞衍生的条件培养基和/或成体干细胞制造技术

本发明专利技术属于肿瘤治疗处理领域。已发现条件培养基发挥显著的抗肿瘤作用，该条件培养基通过在液体细胞培养基内培养能够分化成多种分化细胞类型的成体干细胞和/或从中可获得该条件培养基的成体干细胞而获得。在这种治疗应用中优选的成体干细胞衍生的条件培养基为衍生自人类肝脏干细胞（HLSC-CM）的无细胞条件培养基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗处理肿瘤疾病的成体干细胞衍生的条件培养基和/或成体干细胞本专利技术涉及肿瘤疾病的治疗处理领域。转移性癌症细胞与干细胞共有许多特征如它们自我更新和产生多种后代（progency）的能力。此外，干细胞和癌细胞的表型受微环境的影响很大。同时，胚胎微环境已显示了抑制多种癌细胞株（癌细胞系）的致肿瘤性。结果表明，在原肠胚形成之前，将转移性黑素瘤细胞暴露在胚胎斑马鱼的微环境中，导致它们重新编程趋向非致瘤表型（CucinaA，等人（2006）.Zebrafishembryoproteinsinduceapoptosisinhumancoloncancercells（斑马鱼胚胎蛋白质诱导人类结肠癌细胞凋亡）（Caco2）。Apoptosis11:1615–1628；LeeLM，等人（2005）.Thefateofhumanmalignantmelanomacellstransplantedintozebrafishembryos:Assessmentofmigrationandcelldivisionintheabsenceoftumorformation（人类恶性黑素瘤细胞移植到斑马鱼胚胎中的命运：缺乏肿瘤形成的情况下迁移和细胞分裂的评估）.DevDyn233:1560-1570）。此外，所述移植到发育中鸡胚的转移性黑素瘤细胞能跟踪神经嵴迁移路径，导致致肿瘤性的丧失和神经嵴样表型的获取。最近研究表明，人类胚胎干细胞（hESC）微环境，具体地将在转移性黑素瘤和乳腺癌细胞内胚胎形态Nodal的表达失效，使它们重新编程至低侵略性表型（PostovitLM等人（2008）.Humanembryonicstemcellmicroenvironmentsuppressesthetumorigenicphenotypeofaggressivecancercells（人类胚胎干细胞微环境抑制所述侵略性癌细胞的致瘤表型）.PNAS105:4329–4334）。PostovitLM等人揭示了hESC-分泌型Lefty，一种Nodal信号的抑制剂，作为这些现象的重要媒介物（mediator）。这些研究表明胚胎干细胞的微环境提供了一种以前未开发的用于在侵略性肿瘤细胞中调节异常表达的胚胎因子的治疗物质（therapeuticentity）。在GiuffridaD等人，Humanembryonicstemcellssecretesolublefactorsthatinhibitcancercellgrowth（人类胚胎干细胞分泌抑制癌细胞生长的可溶性因子）.CellProlif.2009年9月1日中，结果表明对人类上皮癌细胞株增殖的抑制通过hESC产生的可溶因子进行介导。作者发现，在G（1）阶段癌细胞的比例通过hESCCM处理增加，伴随在S和G（2）/M阶段细胞的减少，表明这些因子通过细胞周期抑制使癌细胞的进程减慢。然而，通过胚胎干细胞已达到了这样的结果，这些胚胎干细胞很难获得并且引起伦理和方法学问题，原因是需要破坏胚胎以获得胚胎干细胞。此外，胚胎干细胞在体内移植时经受不受控制的增殖。本专利技术人在作为WO2006/126219公布的国际专利申请中披露了人类成体非卵圆肝脏干/祖细胞（HLSC），其表达间充质和胚胎干细胞标记且具有多能分化能力和再生性能。虽然在WO2006126219中HLSC被定义为“多能祖细胞”，但应理解是，“祖细胞”和“干细胞”的表达均是指能够自我更新并分化成专化（即分化）细胞类型的细胞。此外，在本专利技术背景中的术语“多能（multipotent）”和“多能性（pluripotent）”被认为可互换，因为它们都是指干/祖细胞分化成多种专化（分化）细胞类型的能力。在此背景下，术语“多种”是指至少两种，优选地至少三种，专化（specialized）（分化）细胞类型。在本专利技术背景下，表达“成体干细胞”意思是从成体组织中分离的干细胞，与从胚泡内部细胞群分离的“胚胎干细胞”相对。成体干细胞也被称为“体干细胞（somaticstemcells）”。WO2006/126236中披露的人类非卵圆肝脏多能祖/干细胞显示经历分化成多种组织细胞类型（即，成熟肝脏细胞、上皮细胞、产胰岛素细胞（胰岛素分泌细胞，insulin-producingcell）和骨原细胞）并发挥器官再生作用。这种细胞衍生于非卵圆人类肝脏多能祖细胞株，其表达肝细胞标记。这种细胞通过包括以下步骤的方法分离：（i）在细胞培养基中培养成体肝脏衍生的人类成熟肝细胞直至成熟肝细胞死亡并选择具有上皮样形态的存活细胞群。（ii）通过以下扩散（扩增，expand）具有上皮样形态的存活细胞群：在含血清、含葡萄糖的培养基中培养，补充有hEGF（人类上皮生长因子）和bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）且含哺乳动物细胞生长所必需的一般无机盐、氨基酸和维生素，且特别地其中所述成熟肝细胞在含血清培养基中在防冷冻剂存在下冷冻，然后根据步骤（i）在培育之前解冻（冻融）。WO2006/126236中披露的人类非卵圆肝脏干/祖细胞的特征及其制备方法全部引入本文以供参考。本领域也已知间充质干细胞（MSC）制剂在一些组织上发挥再生作用。例如，熟知骨髓衍生的MSC通过分泌大量营养分子，包括可溶细胞外基质糖蛋白，细胞因子和生长因子，自然地支持造血功能。然而，当被给予时，一些干细胞制剂具有引起免疫反应的主要缺点。一些干细胞制剂甚至可能导致癌症。本专利技术人已经发现条件培养基（conditionedmedium，CM）出乎意料地显示一种有效的抗肿瘤活性，该条件培养基来源于在液体细胞培养基中培养未充分分化的能够产生多种分化的细胞类型的成体干细胞（adultstemcell），这正如说明书的以下实验部分中描述的体外和体内实验所证实的。本专利技术的用于抗肿瘤治疗应用的所述条件培养基（CM）包括多种分子和生物分子，尤其是蛋白质，更尤其是培养期间由所述干细胞分泌的细胞因子。因此，本专利技术的第一个方面是一种条件培养基，该条件培养基包括多种细胞分泌蛋白质（cell-secretedprotein）并可通过在液体细胞培养基中培养能分化成多种分化细胞类型的成体干细胞来获得，其用于肿瘤疾病的治疗处理。在一个优选的实施方式中，所述条件培养基是无细胞的。在另一个实施方式中，所述条件培养基包含由成体干细胞（所述条件培养基从中获得）组成的细胞组分（细胞碎片，cellfraction）。可替换地，如上面限定的所述成体干细胞本身用于肿瘤疾病的治疗处理。本专利技术的另一个方面是所述条件培养基的应用，该条件培养基包括多种细胞分泌的蛋白质并可通过在液体细胞培养基中培养能分化成多种分化细胞类型的成体干细胞来获得，该应用是用于制备治疗处理肿瘤疾病的药物。所述无细胞的或含所述细胞组分的条件培养基适用于肿瘤疾病的治疗处理。然而，优选所述无细胞的条件培养基。根据本专利技术的优选实施方式，适用于治疗处理肿瘤疾病的所述无细胞的条件培养基，例如，可通过包括以下步骤的方法获得：（i）将能够分化成多种分化细胞类型的成体干细胞在液体细胞培养基中培养预定的时间段，和；（ii）从所述液体细胞培养基中去除细胞组分，从而获得包含多种细胞分泌的蛋白质的无细胞条件培养基。本专利说明书的实验部分披露本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.09 EP 09425504.91.一种无细胞的条件培养基在制备用于通过诱导肿瘤细胞凋亡治疗处理肿瘤疾病的药物中的应用，所述条件培养基含有多种细胞分泌蛋白质并且其通过在液体细胞培养基中培养来源于成体肝脏组织的非卵圆人类肝脏多能祖细胞(HLSC)而获得，其中所述非卵圆人类肝脏多能祖细胞(HLSC)表达标记白蛋白和α-胎蛋白，并且所述肿瘤疾病选自包括以下的组中：肝肿瘤、上皮性肿瘤、乳腺肿瘤，以及所述条件培养基是不含胎牛血清的条件培养基。2.根据权利要求1所述的应用，其中所述条件培养基通过包括以下步骤的方法获得：(i)将能够分化成多种分化细胞类型的来源于成体肝脏组织的非卵圆人类肝脏多能祖细胞(HLSC)在液体细胞培养基中培养预定的时间段；和(ii)从所述液体细胞培养基中去除所述细胞组分，从而获得包含多种细胞分泌蛋白质的无细胞的条件培养基。3.根据权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：玛利亚·比阿特丽斯·赫雷拉桑切斯，瓦伦丁娜·丰萨托，奇罗·泰塔，乔瓦尼·卡穆西，
申请(专利权)人：弗雷森纽斯医疗护理德国有限责任公司，
类型：发明
国别省市：