本发明专利技术涉及提供由人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法，所述方法包含以下步骤：a)由人类多能干细胞形成胚胎体；b)使所述胚胎体附着到培养皿以诱导所述胚胎体自然分化为间充质干细胞；以及增殖c)执行所述间充质干细胞的连续增殖性培养，同时仍维持所述间充质干细胞的一致性。此外，本发明专利技术涉及提供用于诱导间充质干细胞分化的标准化方法，不管其遗传背景差异如何，都可广泛应用于所有人类多能干细胞。最终，本发明专利技术可通过使用人类多能干细胞以连续方式大规模生产再生医学和干细胞治疗所必需的间充质干细胞。因此，可从而实现细胞治疗产品的实际用途，且进一步来说，本发明专利技术预计大大有助于对例如心血管病和神经障碍等不易治疗病症的治疗。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种由人类多能干细胞诱导间充质干细胞的方法、通过所述方法产生的间充质干细胞以及包含间充质干细胞的细胞治疗产品。
技术介绍
干细胞是能够分化为构成有机体组织的多种细胞的细胞，且一般指分化之前的未分化细胞，其可获自胚胎、胎儿和成人身体的各个组织。干细胞通过分化刺激(环境)分化为特定细胞；与因分化完成而引起其细胞分裂已停止的细胞不同，干细胞允许通过经由细 胞分裂(自我更新)产生与其本身相同的细胞来进行增殖(扩增)；且由于在不同环境下或通过不同的分化刺激，干细胞可分化为其它细胞，因此干细胞在分化过程中具有可塑性。干细胞根据其分化能力可分为多能(pluripotent)、多效(multipotent)和单能(unipotent)干细胞。多能干细胞为具备全能性以分化为所有细胞的多能细胞，且这些多能干细胞包含胚胎干细胞(ES细胞)以及诱导性多能干细胞(iPS细胞)等。成体干细胞可为多效和/或单能干细胞的实例。胚胎干细胞由早期胚胎发育中胚细胞的内细胞团形成；具备全能性以分化为所有细胞从而使得其能够分化为任何种类的组织细胞；可以永生和未分化状态的形式培养；与成体干细胞不同，可通过生殖细胞的制备遗传到下一代(汤姆逊(Thomson)等人，科学(Science)，282，1145-1147，1998 ;瑞比诺夫(Reubinoff)等人，自然生物技术(Nat,Biotechnol.)，18 ;399_404，2000)。通过在人类胚胎形成的时候仅分离并培养内细胞团来制备人类胚胎干细胞，且当前，已从灭菌操作后剩余的冷冻胚胎中获得全局制备的人类胚胎干细胞。为使用能够分化为所有细胞的多能人类胚胎干细胞作为细胞治疗产品，已进行了各种尝试；然而，这些尝试尚未完全克服例如致癌和免疫排斥风险等高障碍。作为对这些尝试的一种补充，最近已对诱导性多能干(iPS)细胞进行了报道。包含在多能干细胞概念中的iPS细胞为通过去分化成体细胞获得的细胞，所述成体细胞的分化以若干方式结束，因而在分化的早期阶段恢复为胚胎样状态。到目前为止，已有报道称鉴于基因表达和分化能力，去分化的细胞呈现出与胚胎干细胞(其为多能干细胞)几乎相同的特性。这些iPS细胞还可使用自体细胞，因而排除了免疫排斥的风险，然而肿瘤发生的风险仍然是需要解决的问题。近来，已提供了具有免疫调节功能并且无肿瘤发生风险的间充质干细胞作为用于解决这些问题的替代方法。间充质干细胞为能够分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞等的多效细胞，且已报道具有调节免疫反应的功能。间充质干细胞可从各种组织分离出来并培养，但它们的能力和细胞表面标记依据其来源而互不相同。因此，并不容易清楚地界定间充质干细胞。然而，间充质干细胞通常由可分化为骨细胞、软骨细胞和肌细胞的细胞界定；具有螺旋形式；并且表达⑶73(+)、⑶105(+)、⑶34(-)和⑶45 (-)，这些是基本的细胞表面标记。同时，为使间充质干细胞用作细胞治疗产品，再生医学和/或细胞治疗领域所需的约IXIO9最少数量的细胞需得到满足。然而，在考虑用于设定条件和标准的实验时，实际需要的细胞数量进一步增加。因此，体外实验中需要至少10次传代以由获自各种来源的现有间充质干细胞提供所述量的细胞。在这种情况下，细胞变得老化并经修饰，因此，它们可能不会再适于用作细胞治疗产品。虽然已通过使用这些细胞来设定条件和标准，但可能会出现一些问题这些细胞可能在实际用于治疗中之前就已变得枯竭，从而需要使用来自他人的间充质干细胞，且在这种情况下，由于使用不同的细胞而需要进行额外的实验。解决现有间充质干细胞培养系统的上述问题的最理想替代方法是使用人类多能干细胞来产生间充质干细胞。然而，到目前为止，诱导人类多能干细胞分化为间充质干细胞已需要由特定细胞因子(例如，BMP、bFGF)进行诱导程序(这成本很高且需要控制浓度)或对具有异种病原体风险的异种饲养细胞(0P9小鼠细胞株)进行诱导程序以及其后通过特定标记(例如⑶73)进行分选。此外，就通过这些方法产生的间充质干细胞来说，很难维持其基本状态且生产效率不高。此外，具有不同遗传背景的人类多能干细胞具有不同的生理机制，从而无法使用用于诱导间充质干细胞分化的现有方法(这些方法先前是在特定系中建立)。因此，为从具有不同遗传起源的人类多能干细胞诱导间充质干细胞具有一定的难度，需要开发和应用其它的分化诱导方法。鉴于这些原因，在再生医学和细胞治疗领域中，间充质干细胞在用作理想细胞治疗产品时具有局限性。
技术实现思路
技术问题本专利技术提供间充质干细胞的高效率大规模生产方法，其通常适用于具有各种遗传背景的人类多能干细胞。此外，本专利技术还提供通过所述方法产生的间充质干细胞、包含间充质干细胞的细胞治疗产品以及用于由人类多能干细胞产生间充质干细胞的标准化培养系统。技术方案为解决上述问题，本专利技术提供由人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法，所述方法包含a)由人类多能干细胞形成胚胎体；b)使胚胎体附着到组织培养皿，然后诱导胚胎体自发分化为间充质干细胞；以及c)执行间充质干细胞的连续增殖性培养，同时维持间充质干细胞的一致性。具体来说，分化诱导可包含通过自体细胞因子回路的形成诱导自发分化以及具有使用培养基的特性，所述培养基包括人表皮生长因子(hEGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(hFGF-B)、胰岛素样生长因子(IGF-I)、氢化可的松(hydrocortisone)、抗坏血酸等，可使用类似物以维持并以增殖性方式培养经分化诱导的间充质干细胞。技术效果 本专利技术提供用于诱导间充质干细胞分化和增殖性培养间充质干细胞的标准化方法，不管其遗传背景的差异如何，都能够广泛应用于所有的人类多能干细胞。进一步来说，本专利技术可以连续方式大规模生产间充质干细胞，作为用于细胞治疗产品的最佳资源，同时仍维持间充质干细胞的一致性。进一步来说，本专利技术能够克服因异种饲养细胞的诱导而引起的异种病原体的风险以及可能由于荧光激活细胞分选器(FACS)进行的分选而造成的细胞损伤，且允许以低成本得到间充质干细胞的高效率生产。最终，本专利技术可通过使用人类多能干细胞，很容易地大规模生产间充质干细胞(其可理想地用于再生医学和细胞治疗中)，从而实现细胞治疗产品的实际用途。此外，本专利技术预计大大有助于对例如心血管病和神经障碍等不治之症的治疗。附图说明图Ia显示诱导人类多能干细胞分化为间充质干细胞以及间充质干细胞的增殖性培养。图Ib显示通过利用聚合酶链反应,与7天胚胎体(embryonic bodies on day 7of culture)和 14天胚胎体(embryonic bodies on day 14 of culture)的间充质分化相 关的基因表达差异的定量结果。图Ic显示通过对14天胚胎体染色，在间充质分化的早期阶段基因蛋白质表达的验证结果。图2a显示在胚胎体附着时对14天胚胎体的分选。图2b显示在通用培养基中培养胚胎体时起始诱导分化为间充质干细胞，通用培养基中不会添加外部细胞因子。图2c和图2d分别显示在以不利用以及利用诺金(Noggin)(其为BMP拮抗剂)处理过的群组中分化为间充质干细胞的诱导过程。图3显示EGM-2MV培养基与 -MEM培养基(其为本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.10.27 KR 10-2009-01024581.一种由人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法，所述方法包括 a)由人类多能干细胞形成胚胎体； b)使所述胚胎体附着到培养皿以诱导所述胚胎体自发分化为间充质干细胞；以及 c)以增殖性方式培养所述间充质干细胞，同时维持所述间充质干细胞的一致性。2.根据权利要求I所述的方法，其中将步骤a)的所述人类多能干细胞培养14天以形成所述胚胎体。3.根据权利要求I所述的方法，其中在含有胎牛血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基的碱性组分中培养步骤b)的所述胚胎体，从而诱导其分化。4.根据权利要求I所述的方法，其中通过在不添加外部细胞因子的情况下形成自体细胞因子回路而出现步骤b)的所述自发分化的诱导。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述自体细胞因子为骨形态发生蛋白。6.根据权利要求I所述的方法，其中通过使用含有人表皮生长因子、血管内皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、氢化可的松以及抗坏血酸的培养基来培养步骤c)的所述间充质干细胞。7.一种间充质干细胞,其由根据权利要求I到6中任一权利要求所述的方法产生。8.一种细胞治疗产品，其包括根据权利要求7所述的间充质干细胞。9.根据权利要求8所述的细胞治疗产品，其中所述细胞治疗产品形成选自由脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞以及心...
【专利技术属性】
技术研发人员：金孝洙，姜炫在，李银珠，朴永培，
申请(专利权)人：财团法人首尔大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：
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