用于CD34-阴性干细胞的扩增培养基制造技术

本发明专利技术提供细胞生长培养基，其包含(a)无直径大于0.22μm的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基的总体积的2％至15％；(b)无直径大于0.22μm的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基的总体积的1％至10％；(c)浓度为所述细胞生长培养基的0U/ml至10U/ml的肝素；(d)浓度为0.5mM至10mM的L-谷氨酰胺；和(e)适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基，其中所述无血清低葡萄糖培养基构成所述细胞生长培养基的总体积的75％至97％，并且可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述细胞生长培养基允许人类CD34”干细胞的扩增，且其中得到的经扩增的CD34”干细胞保持分化的能力。本发明专利技术还提供了相关的细胞生长培养基补充物、无菌的人类血小板裂解物和人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物、试剂盒、含CD34’干细胞的组合物，以及相关的生产和细胞扩增方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于CD34-阴性干細胞的扩增培养基本申请要求2009年12月23日提交的申请号为61/289，796的美国临时申请的优先权,其全部内容通过引用并入本文。本申请通篇引用了不同的出版物。这些出版物的公开内容在此通过引用并入本申请，以便更全面地描述本专利技术涉及的技术现状。
技术介绍
来源于骨髓和脐血的人类非造血干细胞越来越多地被用作用于患者的再生和免疫调节指征的间充质细胞。在全球范围内已经利用间充质干细胞实施了超过80例临床试验。几乎所有的研究人员都使用含胎牛血清(FBS)的培养基作为标准血清补充物。FBS是牛源的，可以传播TSE(即可传播性海绵状脑病)和刺激接受者的免疫应答。只有无BSE的牛被权威机构核准用于人类(新西兰)，研究人员正努力研发用于促进细胞生长的替代方法。由于细胞疗法很可能在未来几年将被越来越多地使用，随之而来的将是FBS的短缺。ー些公司已经研发了无血清培养基。但是这些培养基显示出比理想的生长速率低的生长速率，骨髓源性CD34-阴性干细胞的形态和性质在这些培养基中不能如在含FBS培养基中那样广泛表征。人类凝血细胞(即血小板)已经被其他研究人员用作新鲜冰冻血浆(FFP)，用作促生长成分。血小板及其用于再生医学的潜在意义由Stellos和Gawaz,以及Langer和Gawaz分别评述。关于使用血小板或FFP的干细胞扩增可提及本领域的下列具体教导。Schallmoser等人公开了使用血小板裂解物的间充质干细胞扩増。Capelli等人公开了未过滤的人类血小板裂解物用于扩增和生产间充质基质细胞的用途。Kocaoemer等人公开了人类AB血清和凝血酶激活的富血小板血浆在扩增来自脂肪组织的间充质干细胞中的用途。Muller等人公开了用于分离和扩增来自人类骨髄的多潜能间充质基质细胞的无动物血清培养条件，所述条件使用FFP和血小板两者。Blande等人公开了脂肪组织间充质干细胞在无动物血清培养基中的扩增，所述无动物血清培养基中补充有已经无菌过滤的人自体血小板裂解物。而且，SalvadS等人公开了血小板裂解物在培养间充质基质细胞中的用途，其中所述裂解物是无菌过滤的。尽管血小板裂解物和FFP用于培养间充质干细胞的已知用途，仍然存在未满足的需求，即更快速、更低廉和更安全地以稳定方式培养这种细胞，同时保留其以后在需要时进行分化的能力。
技术实现思路
本专利技术提供了一种细胞生长培养基，其包含(a)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基的总体积的2%至15% ；(b)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基的总体积的1%至10% ；(c)浓度为所述细胞生长培养基的OU/ml至10U/ml的肝素；(d)浓度为O. 5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；和(e)适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基，其中所述无血清低葡萄糖培养基构成所述细胞生长培养基的总体积的75%至97%，且可以包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，所得经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力。本专利技术还提供了一种细胞生长培养基补充物，其包含 (a)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基补充物的总体积的17%至94% ;和(b)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基补充物的总体积的6%至83% ；其中在将所述细胞生长培养基补充物与肝素和含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞生长培养基时，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且所得经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力，所述细胞生长培养基包含(i)3体积％至25体积％的细胞生长培养基补充物；(ii)浓度为OU/ml至10U/ml的肝素；和(iii)浓度为O. 5mM至IOmM的L-谷氨酰胺。本专利技术另外提供了ー种无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中根据下列步骤制备所述血小板裂解物(i)冷冻血小板浓缩物,从而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的经裂解的血小板；(iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板；(iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再次离心来自步骤(iii)的上清液；和(V)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。本专利技术还另外提供了ー种无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中根据下列步骤制备所述FFP滤出物⑴融化FFP ；(ii)以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心融化的FFP ;和(iii)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后ー次过滤。本专利技术还提供了ー种用于扩增人类⑶34_干细胞的试剂盒，其在分开的区室中包含(a)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，和(b)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中⑴所述裂解物构成(a)和(b)合并的体积的17%至94%; (ii)所述FFP滤出物构成(a)和(b)合并的体积的6%至83%，和(iii)在将所述裂解物和所述滤出物与肝素和含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞生长培养基时，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且所得经扩增的CD34—干细胞保持分化的能力，其中(i)所述试剂盒的内容物构成所述培养基体积的3%M 25% ;和(ii)肝素的浓度为OU/ml至I OU/ml 0本方明还提供了ー种物质组合物，其包含(a)人类⑶34_干细胞和(b)上述任意 实施方式的主题细胞生长培养基。本专利技术另外提供了一种用于制备无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物的方法，其包括下列步骤(i)冷冻血小板浓缩物,从而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的经裂解的血小板；(iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板；(iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再离心来自步骤(iii)的上清液；和(V)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。本专利技术还另外提供了一种用于制备无直径大于0.22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物的方法，其包括下列步骤⑴融化FFP ；(ii)以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心融化的FFP ;和(iii)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5 μ m的孔的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.23 US 61/289,7961.细胞生长培养基，其包含 (a)无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基的总体积的2%至15% ； (b)无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基的总体积的1%至10% ； (c)浓度为所述细胞生长培养基的OU/ml至10U/ml的肝素； (d)浓度为O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；和 (e)适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基，其中所述无血清低葡萄糖培养基构成所述细胞生长培养基的总体积的75%至97%，且所述无血清低葡萄糖培养基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺； 其中所述细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，所得经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力。2.如权利要求I所述的细胞生长培养基，其中根据下列步骤制备部分(a)的血小板裂解物 (i)冷冻人类血小板浓缩物，从而使其中的血小板裂解； ( )融化所得经裂解的血小板； (iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板； (iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再离心来自步骤(iii)的上清液；和 (v)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后ー次过滤。3.如权利要求2所述的细胞生长培养基，其中如下制备步骤(i)的人类血小板浓缩物离心血小板并由此使其成丸；分离成丸的血小板和液相；并在FFP中重悬得到的血小板。4.如权利要求I 3之一所述的细胞生长培养基，其中如下制备部分(b)的FFP滤出液融化人类FFP ;以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心所得融化的FFP ;和使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5μπι的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。5.如权利要求I 3之一所述的细胞生长培养基，其中如下制备部分(b)的FFP滤出液⑴融化人类FFP ； (ii)冷冻融化的人类FFP ; (iii)融化所得的人类FFP ;和(iv)以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心所得融化的FFP。6.如权利要求5所述的细胞生长培养基，其中在离心步骤(iv)之前至少再一次冷冻和融化来自步骤(iii)的融化的FFP。7.如权利要求5或6之一所述的细胞生长培养基，其中省略对得自步骤(iv)的液体部分的过滤。8.如权利要求I 7之一所述的细胞生长培养基，其中所述细胞生长培养基不含动物血清。9.如权利要求I 8之一所述的细胞生长培养基，其中所述血小板裂解物和FFP滤出物与血型抗原ABO和Rh相匹配。10.细胞生长培养基补充物，其包含 (a)无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基补充物的总体积的17%至94% ;和 (b)无直 径大于O.22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基补充物的总体积的6%至83% ; 其中在将所述细胞生长培养基补充物与肝素和含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞生长培养基时，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且所得到的经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力，所述细胞生长培养基包含(i)3体积％至25体积％的细胞生长培养基补充物；(ii)浓度为OU/ml至10U/ml的肝素；和(iii)浓度为O. 5mM至IOmM的L-谷氨酰胺。11.如权利要求10所述的细胞生长培养基补充物，其还包含肝素，其中在将所述细胞生长培养基补充物与含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞生长培养基时，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且所得到的经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力，所述细胞生长培养基包含3体积％至25体积％的细胞生长培养基补充物，并且含有OU/ml至10U/ml的肝素。12.如权利要求10和11之一所述的细胞生长培养基补充物，其中根据下列步骤制备部分(a)的血小板裂解物 (i)冷冻人类血小板浓缩物，从而使其中的血小板裂解； ( )融化所得经裂解的血小板； (iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板； (iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再离心来自步骤(iii)的上清液；和 (v)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后ー次过滤。13.如权利要求10 12之一所述的细胞生长培养基补充物，其中根据下列步骤制备部分(b)的FFP滤出物 ⑴融化人类FFP ； ( )以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心融化的FFP ;和 (iii)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5μπι的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。14.如权利要求10 13之一所述的细胞生长培养基补充物，其中所述细胞生长培养基补充物不含动物血清。15.如权利要求10 14之一所述的细胞生长培...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃琳娜·阿塞瓦，克里斯廷·冈瑟，
申请(专利权)人：埃普塞斯有限责任两合公司，
类型：发明
国别省市：