本发明专利技术公开了一种胎盘绒毛板间充质干细胞，其提取方法包括以下步骤：(1)获取胎盘绒毛板；(2)去除血管和绒毛组织；(3)清洗绒毛板至没有血色；(4)将绒毛板剪成0.5‑5mm2的组织微块，清洗；(5)加入含胰酶、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸酶的组织消化液消化；(6)过滤，离心；(7)培养；(8)当细胞融合度达到70‑90％时，用0.25％胰酶消化细胞；(9)传代培养；(10)检测；(11)冻存；(12)建库。该方法步骤简单，能快速从胎盘组织获取大量的间充质干细胞，分离过程中不需要太多清洗操作，也避免了抗生素的使用，分离得到的胎盘绒毛板间充质干细胞的纯度较高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及间充质干细胞的制备
，具体涉及一种胎盘绒毛板间充质干细胞及其提取方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的诱导条件下可以分化形成多种组织来源的细胞，如脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞和成神经细胞等。间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，而且还具有自我更新、归巢、免疫调节、造血支持、分泌多种细胞因子、促进干细胞移植等多种生物学特性，是参与组织损伤修复和组织再生的重要细胞组成部分。目前，可以从多种成体组织(如骨髓)或围产期组织(如胎盘)提取间充质干细胞。骨髓来源的间充质干细胞生物学特性研究最为详尽，该类间充质干细胞在美国、加拿大、韩国都开发出用于疾病治疗的生物制品。但骨髓间充质干细胞不仅含量相当低，约为骨髓单个核细胞的0.0001-0.001％，而且随着供者年龄的增加间充质干细胞的质量和含量都会大幅度降低。此外，从骨髓组织获取间充质干细胞会给供者带来巨大痛苦。因此，寻找一种新的组织来源提取间充质干细胞是目前间充质干细临床应用的一个研究热点。这种组织来源须具有以下几个特点：1)组织获取不存在伦理争议；2)组织容易获取；3)不会给供者带来痛苦；4)间充质干细胞的获取量应足够大；5)获取的间充质干细胞容易分离、纯化。研究表明，围产期胎盘组织获取不存在伦理争议，组织获取相对容易，也不会给供者带来痛苦；从胎盘组织获取的间充质干细胞不仅数量大而且分离纯化也容易。因此，就间充质干细胞提取的材料来源而言，胎盘可作为骨髓组 织的理想替代物。胎盘由绒毛板、绒毛层、基板组成。绒毛膜绒毛从绒毛板长出形成一个个树枝样结构悬挂于绒毛板上，形成所谓的胎盘绒毛层。绒毛间隙是绒毛板和基板形成的闭合腔隙，其中含有大量的母血，而绒毛层中的绒毛就悬浮于绒毛间隙的母血中。基板由胎盘底蜕膜发育而成，属于母体成分；基板向绒毛间隙突起形成胎盘隔，胎盘隔与绒毛将绒毛间隙分隔成一个个小叶形成胎盘小叶。此外，绒毛末梢连接到基板上以防止悬浮于绒毛间隙母血中的绒毛随意移动，起到保护作用。但现有的胎盘间充质干细胞提取方法存在诸多缺点，如细胞不纯、工艺操作复杂等。例如中国专利CN101270349A公开了胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法，该方法采用Ⅳ型胶原酶消化胎盘母体侧蜕膜组织得到胎盘间充质干细胞，而该蜕膜组织实际上为胎盘基板，而绒毛层与基板难以区分，得到的间充质干细胞可能包含了母体和胎儿两种来源的细胞成分。中国专利CN104560869A公开了一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法，该方法通过剪取羊膜下0-1cm厚度范围内绒毛膜组织，清洗干净后通过胶原酶消化获取绒毛膜间充质干细胞。该方法所获得的胎盘组织包含绒毛板、绒毛层、母血细胞成分，所获得的绒毛膜间充质干细胞实际上是绒毛板间充质干细胞、绒毛间充质干细胞、母血细胞的混杂成分，因此并不能单纯地认为是绒毛膜间充质干细胞，而且绒毛层胎盘组织的引入使得组织分离过程中红细胞需要大量清洗液和清洗过程，增加了操作过程的难度。中国专利CN102676451A公开了从胎盘中分离间充质干细胞的方法，该方法采用组织消化酶从胎盘小叶获取间充质干细胞。该方法中的胎盘小叶实际上包括了胎盘绒毛板、绒毛层、基板、母血细胞成分，提取的间充质干细胞是多种细胞的混杂成分，需要后续的纯化工艺进行分离。
技术实现思路
针对于现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了一种胎盘绒毛板间充质干细胞及其提取方法，该方法步骤简单，能快速从胎盘组织获取大量的间充质干细胞，分离过程中不需要太多清洗操作，也避免了抗生素的使用，分离得到的胎盘绒毛板间充质干细胞的纯度较高。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种胎盘绒毛板间充质干细胞的提取方法，包括以下步骤：(1)采集足月胎盘组织，剥离覆盖在胎盘绒毛板外侧的羊膜，并剪取绒毛板组织；(2)使用无菌止血钳或组织镊去除附着在绒毛板上的绒毛和血管组织；(3)用生理盐水或PBS清洗步骤(3)所得的绒毛板至没有血色；(4)将清洗后的绒毛板剪成0.5-5mm2的组织块，然后用生理盐水或PBS清洗2-5次；(5)收集步骤(4)中的组织块，将其加入组织消化液中，于37℃恒温摇床中，100-200r/min消化1-2h；(6)组织消化完毕后加入适量完全培养基终止消化，并用100-200μm筛网过滤去除未消化完全的胎盘组织，于20℃、2000r/min条件下离心3min，弃上清；完全培养基由以下体积分数的组分组成：85％的DMEM(Hyclone)，15％的胎牛血清(Gibco)；(7)将步骤(6)所得细胞按1×104-2×104个细胞/cm2的密度(此处密度为细胞个数与培养瓶底表面积的比计算得来)接种于T175培养瓶中，然后添加20mL完全培养基(与步骤(6)中完全培养基成分相同)，于37℃、5％CO2培养箱中培养；(8)每隔3-5天更换一次培养基，当细胞融合度达到70-90％时，用0.25％ 胰酶(Hyclone)消化细胞；(9)传代培养：消化后进行离心处理，2000r/min离心3min，收集细胞，按1×104-2×104个细胞/cm2的密度(此处密度为细胞个数与培养瓶底表面积的比计算得来)接种于T175培养瓶中，然后添加20mL完全培养基传代培养，得胎盘绒毛板间充质干细胞；(10)针对步骤(9)所得的胎盘绒毛板间充质干细胞，检测以下项目中的至少一项：细胞活性、无菌检测、细胞表面标志物检测、核性检测、HLA-ABC/DR配型；(11)冻存：将传代培养后的胎盘绒毛板间充质干细胞按2×106-8×106个细胞/mL密度重悬冻存于1mL冻存液(2mL冻存管)中，冻存细胞经程序降温至-80℃后转入液氮罐中长期保存；(12)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(9)的冻存细胞进行关联。进一步地，步骤(1)中对胎盘的处理需在采集后72h内进行。进一步地，步骤(5)中组织消化液成分为：0.0625-0.125mg/mL胰酶、1-2mg/mL胶原酶Ⅱ、1-2mg/mL胶原酶Ⅳ、1-2mg/mL透明质酸酶。进一步地，步骤(5)中组织块与消化液的质量体积比为1:5-6(g/mL)。进一步地，步骤(5)中组织消化液成分为：0.125mg/mL胰酶、1.5mg/mL胶原酶Ⅱ、1.5mg/mL胶原酶Ⅳ、1.5mg/mL透明质酸酶。进一步地，步骤(11)中冻存液为含体积分数为10％的DMSO(Origen)的完全培养基。按上述提取方法提取的胎盘绒毛板间充质干细胞。本专利技术提供的一种胎盘绒毛板间充质干细胞及其提取方法，具有以下几种 有益效果：(1)本专利技术所选材料为胎盘绒毛板，绒毛板由羊膜覆盖，有效地阻断了病原微生物的侵入绒毛板组织，在采集和细胞培养都避免了抗生素的使用，适合于临床级胎盘间充质干细胞的开发和建库；绒毛板下层存在着一层细胞滋养层，使得胎盘绒毛板与母血保存相对独立，同时绒毛板分离过程中也不需要太多的清洗操作就可以将红细胞去除；绒毛层的绒毛仅绒毛茎与绒毛板相连，在组织分离时较易去除绒毛层，使得分离的胎盘间充质干细胞纯度较高。(2)本专利技术采用含0.125mg/mL胰酶、1.5mg/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胎盘绒毛板间充质干细胞的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集足月胎盘组织，剥离覆盖在胎盘绒毛板外侧的羊膜，并剪取绒毛板组织；(2)去除附着在绒毛板上的绒毛和血管组织；(3)用生理盐水或PBS清洗步骤(3)所得的绒毛板至没有血色；(4)将清洗后的绒毛板剪成0.5‑5mm2的组织块，然后用生理盐水或PBS清洗2‑5次；(5)收集步骤(4)中的组织块，将其加入组织消化液中，于37℃、100‑200r/min条件下消化1‑2h；组织消化液成分为：0.0625‑0.125mg/mL胰酶、1‑2mg/mL胶原酶Ⅱ、1‑2mg/mL胶原酶Ⅳ、1‑2mg/mL透明质酸酶；(6)组织消化完后加入完全培养基终止消化，并用100‑200μm筛网过滤去除未消化完全的胎盘组织，于20℃、2000r/min条件下离心3min，弃上清；其中，完全培养基由以下体积分数的组分组成：85％的DMEM和15％的胎牛血清；(7)将步骤(6)所得细胞按1×104‑2×104个细胞/cm2的密度接种于T175培养瓶中，然后添加20mL完全培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养；(8)每隔3‑5天更换一次培养基，当细胞融合度达到70‑90％时，用0.25％胰酶消化细胞；(9)传代培养：消化后进行离心处理，2000r/min离心3min，收集细胞，按1×104‑2×104个细胞/cm2的密度接种于T175培养瓶中，然后添加20mL完全培养基传代培养，得胎盘绒毛板间充质干细胞；(10)针对步骤(9)所得的胎盘绒毛板间充质干细胞，检测以下项目中的至少一项：细胞活性、无菌检测、细胞表面标志物检测、核性检测、HLA‑ABC/DR配型；(11)冻存：将传代培养后的胎盘绒毛板间充质干细胞按2×106‑8×106个细胞/mL密度重悬冻存于1mL冻存液中，冻存细胞经程序降温至‑80℃后转入液氮罐中长期保存；(12)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(9)的冻存细胞进行关联。...
【技术特征摘要】
1.一种胎盘绒毛板间充质干细胞的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集足月胎盘组织，剥离覆盖在胎盘绒毛板外侧的羊膜，并剪取绒毛板组织；(2)去除附着在绒毛板上的绒毛和血管组织；(3)用生理盐水或PBS清洗步骤(3)所得的绒毛板至没有血色；(4)将清洗后的绒毛板剪成0.5-5mm2的组织块，然后用生理盐水或PBS清洗2-5次；(5)收集步骤(4)中的组织块，将其加入组织消化液中，于37℃、100-200r/min条件下消化1-2h；组织消化液成分为：0.0625-0.125mg/mL胰酶、1-2mg/mL胶原酶Ⅱ、1-2mg/mL胶原酶Ⅳ、1-2mg/mL透明质酸酶；(6)组织消化完后加入完全培养基终止消化，并用100-200μm筛网过滤去除未消化完全的胎盘组织，于20℃、2000r/min条件下离心3min，弃上清；其中，完全培养基由以下体积分数的组分组成：85％的DMEM和15％的胎牛血清；(7)将步骤(6)所得细胞按1×104-2×104个细胞/cm2的密度接种于T175培养瓶中，然后添加20mL完全培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养；(8)每隔3-5天更换一次培养基，当细胞融合度达到70-90％时，用0.25％胰酶消化细胞；(9)传代培养：消化后进行离心处理，2000r/min离心3min，收集细胞，按1×104-2×104个...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄海森，
申请(专利权)人：四川华皓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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