本发明专利技术提供一种在包含人类脐带间质干细胞(HUCMSCs)的培养基中增殖人类胚胎干(hES)细胞的方法，其中，该培养基作为滋养层。在培养基中，该人类胚胎干(hES)细胞维持胚胎干细胞的特性，如多能性、无限制的未分化增殖及正常的染色体组型。本发明专利技术还提供一种该人类胚胎干(hES)细胞的非致瘤性增殖方法，且该方法不会形成畸胎瘤。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术关于人类多能性干细胞的增殖，尤其是关于人类胚胎干(hES)细胞的非致瘤性增殖。
技术介绍
人类胚胎干(hES)细胞是多能性的，且其具有分化为成人大多数细胞种类的强大能力。因此，该细胞是再生医学的强大保证。该hES细胞令人向往的特殊性质包含不死性、多能性及无限制的未分化生长。传统上，在滋养层(feeder layer)细胞(如小鼠胚胎纤维母细胞(MEFs))上培养多能性胚胎干细胞，以将该细胞维持于未分化状态。该滋养层对于维持该等细胞是必要的；且通常在该滋养层上培养hES细胞直到需要分化时为止。不幸地，该小鼠滋养层维持细胞经常与hES细胞接触而受到污染，虽对于小鼠滋养层维持细胞 不会造成多大功能上的影响，仍因此使小鼠滋养层细胞中培养的hES细胞不适用于临床。已有报告指出，无滋养层培养的人类多能性干(hPS)细胞会很快死亡，或者分化为定型细胞(committed cells)的异源性群体(heterogeneous population)。许多报告已证实，尝试使用无细胞的成分或是至少避免非人类的成分或细胞，来取代该滋养层或维持细胞。该取代物无法展现长期保证的结果，且这样的尝试已证实不足以维持细胞稳固(robust)且继续增殖(propagation)。再者,该取代方式还展现,于无滋养层细胞的培养中，生长于培养基取代物中的hES细胞的确在hES细胞群落周围形成已分化细胞，这是没有实现最理想情况的标志。因此，需要开发使用不造成污染及形成畸胎瘤(teratomas)的另一种滋养层细胞源来培养hES细胞的替代方案。
技术实现思路
一实施方式中，本专利技术提供一种人类多能性干细胞的增殖方法，共同培养人类多能性干细胞与脐带衍生干细胞。该脐带衍生干细胞于培养基中形成滋养层，用于增殖该人类多能性干细胞，且将该人类多能性干细胞维持于未分化状态。一实施方式中，该人类多能性干细胞的增殖为非致瘤性增殖，使得该人类多能性干细胞不会形成畸胎瘤。另一实施方式中，该人类脐带衍生干细胞对于⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、CD166 及 HLA-ABC 为阳性，但对于 CDlq、CD3、CD34、CD45、CD56、CD117 及 HLA-DR 为阴性。该人类脐带衍生干细胞具有成骨(osteogenic)或成脂(adipogenic)细胞分化能力。另一实施方式中，该脐带衍生干细胞为人类脐带间质干细胞(HUCMSCs)，且衍生自人类脐带的华顿氏胶(Wharton’ s jelly)。另一实施方式中，该人类多能性干细胞对于碱性磷酸酶(AP)、Oct-4、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、NANOG, S0X2、NF-200、短尾突变型(brachyury)、ATBFl 或 MAP2 为阳性，且表达⑶F9、GATA4、HANDl或TUJ-I基因。又，于该人类多能性干细胞中MYC被降低调控。另一实施方式中，该人类多能性干细胞为人类胚胎干(hES)细胞，并形成类胚胎体(embryoid bodies)。另一实施方式中，本专利技术提供一种用于增殖人类多能性干细胞的培养基，其中，该培养基包含在培养基中形成滋养层的脐带衍生干细胞。一实施方式中，培养基中的该脐带衍生干细胞为人类脐带间质干细胞(HUCMSCs)。另一实施方式中，本专利技术提供一种用于增殖人类多能性干细胞的试剂盒，其中，该试剂盒包括包含脐带衍生干细胞的培养基，及其使用说明书。在一实施方式中，该试剂盒的培养基中的该脐带衍生干细胞为人类脐带间质干细胞(HUCMSCs)。附图说明 图I显示HUCMSC的形态、免疫表型(immunotyping)及体外分化。生长自组织培养物的华顿氏胶细胞为类纤维母细胞，且具有纺锤状型态(图1A)。流式细胞仪快速地区分HUCMSCs，显示其对于 CDlq、CD3、CD34、CD45、CD56、CDl 17 及 HLA-DR 为阴性，而对于 CD10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、CD 166及HLA-ABC为阳性(图1B)。待成脂细胞分化后，该细胞形成中性脂肪空泡，并含有复数对于油红染料为阳性的脂肪小滴(图1C，上)。于成骨细胞培养基中，该细胞延展而形成矿化基质，该矿化基质于三至四周的培养(cultivation)后被茜红染料显著染色(图1C，下)。通过RT-PCR分析(以GAPDH作为阳性控制组)显示对于成脂(PPARy)及成骨(骨桥蛋白，osteopontin)细胞分化具有专一性的基因表达(图1D)。图IA左的比例尺表示lOOOiim，而图IA及图IC右的比例尺表示100 y m。图2显示生长于HUCMC及MEF滋养层上的未分化人类ES细胞群落的形态。生长于HUCMC上的hES群落图(图2A)及生长于MEF上的hES群落图(图2B)。生长于HUCMC上的群落放大图显示典型的hES细胞形态具有高核质比(图2C及图2D)。图2A及图2B的比例尺表示lOOOiim，而图2C及图2D的比例尺表示100 y m。图3显示生长于HUCMC上的人类ES细胞表现型(phenotype)。使用专一性抗体的该hES群落的免疫染色(immnostaining)显示碱性磷酸酶(图3A)、Oct-4(图3B)、SSEA-4 (图3C)、TRA-l-60 (图3D)、及TRA-1-81 (图3E)的高度表达。于HUCMC上持续培养并继代20次后，在ES细胞中观察到代表性的正常染色体组型(46，XX)(图3F)。比例尺表示 1000 Ii m。图4显示衍生自hES的类胚胎体(FB)的萤光免疫染色。相位差显微镜下显示的类胚胎体(图4A)，及使用NF-200抗体(图4B)、短尾突变型抗体(图4C) ,ATBFl (图4D)、及MAP2 (图4E)的免疫染色。比例尺表示1000 u m。图5显示不同滋养层上hES细胞的不同分化标记的表达。图5A为通过RT-PCR手段说明对于生殖细胞(GDF9)、内胚层(GATA4)、中胚层(HANDl)及外胚层(TUJ-I)有专一性的基因表达。GAPDH作为控制组。图5B说明图5A所显示的基因表达的半定量分析。图6显示当滋养层细胞由HUCMSC变为MEF的发展自hES细胞的畸胎瘤。图6A显示待NOD-SCID小鼠上的滋养层由HUCMSC变为MEF后，畸胎瘤(箭头指示)快速发展自hES细胞。组织切片显示黑色素细胞(melanocyte)的带状物,其具有似视网膜(retina-like)结构(图6B)、似神经管(neurotube-1 ike)结构(图6C-图6E)、生牙上皮(odontogenicepithelium)(图6F)、神经上皮(图6G)、未成熟的软骨(图6H)及未成熟的鳞状上皮(squamoid epithelium)(图 61)。比例尺表不 100 U m。图7显示培养于HUCMSC及MEF上的hES细胞的多能性基因表达。图7A说明培养于 HUCMSC(WJ)及 MEF 上的 hES 细胞(ES)的 0CT4、NANOG, S0X2 及 MYC 的 RT-PCR 分析，并以GAPDH作为内部控制组。图7B说明图7A所显示的基因表达的半定量分析。图7C说明通过西方点墨法分析测量C-MYC蛋白质。图7D说明通过RT-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种增殖人类多能性干细胞的方法，包括共同培养该人类多能性干细胞及脐带衍生干细胞。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁大清，朱堂元，
申请(专利权)人：财团法人佛教慈济综合医院，
类型：发明
国别省市：
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