本发明专利技术涉及应用骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂如Noggin提高干细胞心肌分化效率的新组合物和方法。本发明专利技术还涉及分别通过刺激或不抑制维甲酸信号通路、或通过抑制干细胞内维甲酸信号通路而促进由干细胞形成心房及心室心肌细胞的新组合物和方法。本发明专利技术进一步涉及由所述干细胞形成的心房心肌细胞和心室心肌细胞，以及所述心肌细胞的应用，如用于心脏损伤修复以及筛选用于治疗心脏损伤的新疗法。
【技术实现步骤摘要】
由干细胞制备心肌细胞的方法和组合物及其用途相关申请的交叉引用本申请要求2010年6月13日提交的、名称为“干细胞高效分化为心房和心室的心肌细胞的方法”的中国专利申请201010207603.0的优先权。上述中国专利申请的公开内容通过引用整体并入。
本申请涉及用于提高干细胞的心肌分化效率以及促进干细胞形成心房肌细胞和心室肌细胞的新组合物和方法，以及所述干细胞分化的心房肌细胞、心室肌细胞本身及其应用，例如用于心脏损伤修复与筛选治疗心脏损伤的新疗法。
技术介绍
利用现有的技术从人类胚胎干细胞(hESCs)分化心肌细胞只能获得非特异性分化的由胚胎心房样心肌、心室样心肌以及起搏细胞亚型组成的混合心肌细胞6-9。猪移植研究表明，植入这样的由人类胚胎干细胞分化的混合心肌细胞具有起搏活性，这种活性使心肌细胞移植具有导致室性心律失常的潜在风险10。因此，hESCs分化得到的心肌细胞的这种心肌亚型异质性阻碍了hESCs在心肌修复中的应用1。为引导hESCs分化为所需的心肌亚型，必须揭开心肌亚型特化的分子调控机制。尽管已确定多种生长因子如ActivinA、骨形态发生蛋白4(BMP4)、wnt-3a、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及dickkopf同系物1(DKK1)可促进心脏发生并用于多种hESC心肌分化方案7,8,11，至今仍没有证据表明这些或其它生长因子在hESC分化期间调节心肌亚型特化。确定心肌亚型特化的主要调节因素是降低hESC衍生心肌细胞群体异质性的关键，这对于其以后在再生医学中或作为药物测试系统的应用很重要6,12。中胚层和心脏发育期间，骨形态发生蛋白(BMP)信号被严密控制。在小鼠胚胎中，BMP拮抗剂头蛋白(Noggin)短暂但强表达于E7.5至E8.0日龄胚胎的新月形生心区13。Dkk1，一种心脏发育强效诱导物8,1415，协同增强BMP拮抗剂在爪蟾胚胎的非心源性中胚层特化心脏组织16。已经表明，以BMP4长期处理hESCs将诱导滋养层样细胞分化17，而短期处理可起始中胚层形成18。综合来看，这些结果提示，中胚层形成后抑制BMP信号可以促进心脏的发育。维甲酸(Retinoicacid,RA)信号制约着心脏祖细胞池，且在斑马鱼胚胎中可以利用RA的抑制剂BMS-89453将心区附近侧板中胚层的非心肌前体细胞诱导分化成心肌细胞19，同时RA还调节心脏的前后轴极化20。鸡胚胎实验揭示在胚胎发育的4-6HH阶段心房前体组织经移植可以发育成心室，反之亦然21,22。4HH阶段心原性组织的RA处理激活了心房特异性基因AMHC1在原定发育成为心脏流出道组织的前组细胞中表达23。并且，在小鼠和鸡胚胎中，关键时期抑制RA信号引起发育具有过大心室和变小或缺失心房的胚胎，并且外源性加入RA导致胚胎心脏发育成过大的心房和过小或缺失的心室5,24。此外，小鼠胚胎干细胞研究提示维甲酸促进心房相关基因的表达25。
技术实现思路
一方面，本专利技术提供了一种用于提高干细胞的心肌分化效率的方法，所述方法包括在干细胞的分化起始之后，或干细胞心肌分化起始之后抑制BMP信号。在一个特定的实施方式中，本专利技术提供了用于提高干细胞的心肌分化效率的方法，所述方法包括将已分化形成中胚层的干细胞与骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂相接触，据此所述与BMP拮抗剂相接触的干细胞的心肌分化效率高于未与BMP拮抗剂相接触的干细胞。还提供了由上述方法产生的心肌细胞。进一步提供了包含已分化形成中胚层并经外源性BMP拮抗剂处理的干细胞的组合物。另一方面，本专利技术提供了用于促进由干细胞形成心室肌细胞的方法，所述方法包括抑制已分化形成中胚层的干细胞内的维甲酸信号通路。还提供了由上述方法产生的心室肌细胞。进一步提供了包含已分化形成中胚层并经抑制维甲酸信号通路的外源性试剂处理的干细胞的组合物。又一方面，本专利技术提供了用于促进由干细胞形成心房肌细胞的方法，所述方法包括刺激或不抑制已分化形成中胚层的干细胞内的维甲酸信号通路。还提供了由上述方法产生的心房肌细胞。进一步提供了包含已分化形成中胚层并经刺激维甲酸信号通路的外源性试剂处理的干细胞的组合物。又一方面，本专利技术提供了由干细胞生成心室肌细胞的方法，所述方法包括：1)将干细胞与试剂如bFGF和BMP4相接触以起始干细胞分化；2)经所述试剂如bFGF和BMP4处理的干细胞与另一种试剂如激活素A(ActivinA)相接触以形成中胚层；3)已分化形成中胚层的干细胞与BMP拮抗剂例如Noggin相接触，以提高所述干细胞的心肌分化效率；4)抑制经BMP拮抗剂如Noggin处理的干细胞内的维甲酸信号通路以促进心室肌细胞形成；以及5)经BMP拮抗剂如Noggin处理的干细胞与wnt抑制剂例如DKK1相接触，使所述干细胞分化为心室肌细胞。还提供了由上述方法产生的心室肌细胞。又一方面，本专利技术提供了由干细胞生成心室肌细胞的方法，所述方法包括：1)将干细胞与bFGF和BMP4相接触；2)经bFGF和BMP4处理的干细胞与ActivinA相接触；3)经ActivinA处理的干细胞与Noggin相接触；4)抑制经Noggin处理的干细胞内的维甲酸信号通路；以及5)经Noggin处理的干细胞与DKK1相接触。还提供了由上述方法产生的心室肌细胞。又一方面，本专利技术提供了由干细胞生成心房肌细胞的方法，所述方法包括：1)将干细胞与试剂如bFGF和BMP4相接触以起始干细胞分化；2)经所述试剂如bFGF和BMP4处理的干细胞与另一种试剂如ActivinA相接触以形成中胚层；3)已分化形成中胚层的干细胞与BMP拮抗剂例如Noggin相接触，以提高所述干细胞的心肌分化效率；4)刺激或不抑制经Noggin处理的干细胞内的维甲酸信号通路以促进心房肌细胞形成；以及5)经Noggin处理的干细胞与DKK1相接触使所述干细胞分化为心房肌细胞。还提供了由上述方法产生的心房肌细胞。又一方面，本专利技术提供了由干细胞生成心房肌细胞的方法，所述方法包括：1)将干细胞与bFGF和BMP4相接触；2)经bFGF和BMP4处理的干细胞与ActivinA相接触；3)经ActivinA处理的干细胞与Noggin相接触；4)刺激或不抑制经Noggin处理的干细胞内的维甲酸信号通路；以及5)经Noggin处理的干细胞与DKK1相接触。还提供了由上述方法产生的心房肌细胞。又一方面，本专利技术提供了用于治疗心脏损伤或紊乱的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的由上述方法产生的心肌细胞，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。又一方面，本专利技术提供了用于治疗受试者如人类的心脏损伤或紊乱的方法，所述方法包括给有此治疗需要或期望的受试者施用有效量的上述药物组合物。又一方面，本专利技术提供了用于鉴定心肌细胞调节剂的方法，所述方法包括：1)经上述方法产生的心肌细胞与测试物质相接触，并检测测试物质对所述心肌细胞特性的影响；2)检测未与所述测试物质相接触的心肌细胞的特性；据此，与测试物质相接触的心肌细胞特性不同于未与测试物质相接触的心肌细胞特性，鉴定了所述测试物质是心肌细胞特性的调节剂如刺激剂或抑制剂。附图说明图1展示了Noggin(Ngn)和RA抑制剂促进hESC心肌分化。(A)人类ESCs分化为心肌细胞系方案的概述。(B)第14天CTN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于促进由干细胞形成心房心肌细胞的方法，所述方法包括刺激或不抑制已分化形成中胚层的干细胞内的维甲酸信号通路。
【技术特征摘要】
2010.06.13 CN 20101020760301.一种用于促进由来自已建立的细胞系的干细胞形成心房心肌细胞的方法，所述方法包括刺激或不抑制已分化形成中胚层的干细胞内的维甲酸信号通路。2.权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是来自已建立的细胞系的全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞、寡能干细胞或单能干细胞。3.权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是来自已建立的细胞系的胚胎干细胞、诱导的多能干细胞。4.权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是来自已建立的细胞系的哺乳动物干细胞。5.权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物干细胞是来自已建立的细胞系的人类干细胞。6.权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是来自已建立的细胞系的人类胚胎干细胞或人类诱导多能干细胞。7.权利要求1所述的方法，其中所述干细胞已通过未分化干细胞与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、BMP4和/或ActivinA接触而分化形成中胚层。8.权利要求1所述的方法，其中所述干细胞已通过未分化干细胞与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、BMP4和ActivinA接触而分化形成中胚层。9.权利要求1所述的方法，其中所述干细胞已通过未分化干细胞与ActivinA接触之前与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、BMP4接触而分化形成中胚层。10.权利要求1所述的方法，其进一步包括所述干细胞与BMP拮抗剂相接触以提高心肌分化效率。11.权利要求10所述的方法，其中所述BMP拮抗剂是BMP4拮抗剂。12.权利要求11所述的方法，其中所述BMP拮抗剂是Noggin。13.权利要求1所述的方法，其中所述维甲酸信号通路通过所述干细胞与维甲酸或维生素A相接触而刺激。14.权利要求10所述的方法，其中所述干细胞是人类胚胎干细胞或人类诱导多能干细胞，所述BMP拮抗剂是Noggin并通过所述干细胞与维甲酸或维生素A相接触而刺激维甲酸信号通路。15.权利要求1所述的方法，其进一步包含所述干细胞与wnt抑制剂相接触...
【专利技术属性】
技术研发人员：马跃，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。