一种简单高效的干细胞贴片制备方法技术

本发明专利技术涉及一种简单高效的干细胞贴片制备方法，利用自配的羊膜上皮细胞消化液，解决了目前羊膜上皮细胞消化过程复杂，羊膜结构保持不完整的技术难点，该消化液能简单快速的去除羊膜上皮层细胞，不仅可以缩短去羊膜上皮细胞时间，提高上皮细胞消化效率，同时能保持羊膜的完整性及原有的细胞外基质成分，维持其生物学活性，以去上皮细胞的羊膜作为生物支架材料，将脐带来源的间充质干细胞负载在去上皮细胞的羊膜上，制成干细胞贴片，用于临床外敷治疗糖尿病足，起到很好的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，以羊膜作为生物支架材料，用于干细胞的贴壁生长，用于临床糖尿病足创面的修复，具体是一种简单高效的干细胞贴片制备方法。
技术介绍
组织工程是近年来正在兴起的一门新学科，其研究内容主要包括四个方面：种子细胞、生物材料、构建组织和器官的方法和技术以及组织工程的临床应用，核心是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代，因此，支架材料的选择是组织工程中的重要环节，也是限制组织工程临床应用的重要因素。理想的支架材料应具有：1.具有良好的生物相容性，使细胞可黏附和增殖，且无明显的细胞毒性和炎症反应，不影响新组织的功能；2.可降解性，其降解吸收速率与细胞、组织的生长速率相匹配；3.合适的孔径，以利于大量细胞的贴壁和细胞外基质的形成；4.合适的机械强度；5.无抗原性及致瘤性。研究显示，在人羊膜细胞外基质上负载培养的角膜细胞、结膜细胞、成纤维细胞、软骨细胞等均能良好生长，并保持原有的细胞形态及功能。羊膜从细胞滋养层衍化而来，为无血管、神经及淋巴，具有一定韧性和弹性的半透明膜。Bourne扫描电镜下，羊膜可分为上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层、海绵层五层结构，其中，羊膜的基底膜含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原，纤维连接蛋白、层粘连蛋白等，丰富的胶原纤维增强了羊膜的抗拉能力，为细胞生长提供了足够的三维空间结构，有利于细胞在羊膜上黏附和生长，且人羊膜细胞不表达人白细胞A、B、C或DR抗原，具有抗原性极低，免疫排斥反应小的特点。此外，羊膜具有良好的生物相容性，同时也是一种易得的生物材料，易于加工、处理和运输，为组织工程学的研究提供了便利的条件，目前广泛用于眼科、临床烧伤外科及骨科等皮肤、黏膜、神经重建移植的研究中。间充质干细胞具有多能分化潜能，能够被募集在皮肤损伤缺血区和创伤组织中，同时能够分泌多种细胞因子及炎性因子，促进血管的再生和细胞外基质的重建，为创面局部创造一个良好的修复环境，促进创面的修复。目前，临床上主要通过静脉或肌肉注射干细胞治疗糖尿病足，取得了较好的效果，干细胞疗法最为新兴的治疗手段，在糖尿病足的治疗中已经发挥了其独特的优势及潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简单高效的干细胞贴片制备方法，利用本专利技术配制的上皮细胞消化液，使上皮细胞的去除过程方便、快捷，大大缩短整个操作过程所需的时间。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种简单高效的干细胞贴片制备方法，步骤如下：一、羊膜组织的获取及前处理；二、羊膜上皮细胞的消化与刮除；三、羊膜上皮细胞消化后的鉴定；四、制备干细胞贴片。2、根据权利要求1所述的简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：所述羊膜组织的获取及前处理的步骤如下：⑴取健康剖腹产产妇胎盘，用胶体金、荧光定量PCR的方法检测产妇血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA,抗-HDV，抗HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA,CMV-DNA，检测结果均为阴性的胎盘方可使用；⑵将胎盘装入无菌采样袋中，密封后4℃条件下进行运输；⑶对装有胎盘的采样袋外包装进行彻底的酒精消毒后，放入生物安全柜中⑷将胎盘从无菌袋中取出，放置于无菌不锈钢盆中，脐带面向上；⑸用眼科剪刀沿脐带根部与胎盘连接处轻轻剪出一个小口，双手持眼用镊子分离胎盘的羊膜层与绒毛膜层；⑹将分离得到的羊膜放入PH7.2的PBS缓冲液中，清洗羊膜组织3次，彻底将羊膜组织上的血凝块、血管清洗感觉，羊膜呈半透明状为止；⑺将羊膜上皮细胞面向上，平铺到合适大小的硝酸纤维素膜上，形成羊膜-硝酸纤维素膜复合体⑻用无菌眼科剪将羊膜-硝酸纤维素膜复合体剪成约8.0cm*8.0cm大小的小块而且，所述刮除羊膜上皮细胞的消化和刮除具体步骤如下：⑴羊膜上皮细胞消化液的配制：将0.4％胰蛋白酶，0.05％乙二胺四乙酸，0.027％磷酸二氢钾，0.142％磷酸氢二钠溶于1000毫升去离子水中，充分溶解后用0.22μm的过滤装置过滤除菌，4℃保存；⑵将羊膜-硝酸纤维素膜复合体平铺于无菌培养皿中，加入配制好的羊膜上皮细胞消化液，使消化液能完全覆盖羊膜上表面⑶将培养皿置于5％CO2培养箱中，37℃孵育30min进行羊膜上皮细胞的消化；⑷取出培养皿，将羊膜-硝酸纤维素膜复合体从培养皿中取出，浸泡在PBS缓冲液中清洗3次，以洗净消化液；⑸将洗净后的羊膜-硝酸纤维素膜复合体平铺在培养皿中，一手持镊子捏住羊膜-硝酸纤维素膜，一手持细胞刮刀，按同一个方向轻轻刮去羊膜上皮细胞，同时转动羊膜-硝酸纤维素膜，彻底刮除羊膜上皮细胞；⑹将刮除羊膜上皮细胞的羊膜-硝酸纤维素膜复合体用PBS缓冲液清洗羊膜上皮面3次，以彻底清除残留的上皮细胞；而且，所述羊膜上皮细胞消化后鉴定的具体步骤如下：⑴用无菌眼科剪剪取羊膜-硝酸纤维素膜复合体的一角，去除硝酸纤维素膜，将羊膜直接平铺于盖玻片上，使羊膜上皮面朝上，且羊膜完全展开，置于培养皿中；⑵在羊膜上皮面上滴加苏木精，使苏木精完全覆盖羊膜上皮面，室温浸染5分钟后，向培养皿中加入自来水清洗苏木精，反复清洗3次，清洗完成后吸尽培养皿中的自来水；⑶在羊膜上皮面上滴加分化液进行分化，使之完全覆盖羊膜上皮面，分化15秒；向培养皿中加入自来水，使整张盖玻片完全浸泡在自来水中，浸泡15分钟；用移液管吸尽自来水，将伊红滴加至羊膜上皮面上，浸染2分钟；⑷向培养皿中加入自来水，清洗羊膜上皮面，镜下观察着色情况，观察镜下是否还能观察到清晰完整的羊膜上皮细胞；镜下观察不到清晰完整上皮细胞的羊膜可用于羊膜爬片的制备；而且，所述制备干细胞贴片的制备步骤如下：⑴用眼用镊子小心的将去上皮细胞羊膜一端掀起，并将无菌石英片缓缓插入到羊膜下表面，待石英片完全深入到羊膜下方后，用镊子轻轻将羊膜包裹在石英片的四周，并使石英片表面上的羊膜完全伸展；⑵将羊膜爬片置于6cm无菌培养皿中，放入CO2培养箱中干燥60min，使羊膜爬片与孔底结合牢固；⑶取1mL细胞悬液，缓慢加入到装有羊膜爬片的6cm无菌平皿中；⑷再添加4mL含10％FBS的DF-12培养基，轻轻摇匀，不能使羊膜爬片飘起，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育培养；⑸24h后观察培养基颜色的变化及细胞贴壁情况；⑸48h后将培养皿取出，用微量移液枪吸去孔中的培养基，向培养皿中加入3mLPBS，重复本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：步骤如下：一、羊膜组织的获取及前处理；二、羊膜上皮细胞的消化与刮除；三、羊膜上皮细胞消化后的鉴定；四、制备干细胞贴片。

【技术特征摘要】
1.一种简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：步骤如下：
一、羊膜组织的获取及前处理；
二、羊膜上皮细胞的消化与刮除；
三、羊膜上皮细胞消化后的鉴定；
四、制备干细胞贴片。
2.根据权利要求1所述的简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：所述羊膜组织的获取及前处理的步骤如下：
⑴取健康剖腹产产妇胎盘，用胶体金、荧光定量PCR的方法检测产妇血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA,抗-HDV，抗HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA,CMV-DNA，检测结果均为阴性的胎盘方可使用；
⑵将胎盘装入无菌采样袋中，密封后4℃条件下进行运输；
⑶对装有胎盘的采样袋外包装进行彻底的酒精消毒后，放入生物安全柜中；
⑷将胎盘从无菌袋中取出，放置于无菌不锈钢盆中，脐带面向上；
⑸用眼科剪刀沿脐带根部与胎盘连接处轻轻剪出一个小口，双手持眼用镊子分离胎盘的羊膜层与绒毛膜层；
⑹将分离得到的羊膜放入PH7.2的PBS缓冲液中，清洗羊膜组织3次，彻底将羊膜组织上的血凝块、血管清洗感觉，羊膜呈半透明状为止；
⑺将羊膜上皮细胞面向上，平铺到合适大小的硝酸纤维素膜上，形成羊膜-硝酸纤维素膜复合体
⑻用无菌眼科剪将羊膜-硝酸纤维素膜复合体剪成约8.0cm*8.0cm大小的小块。
3.根据权利要求1所述的简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：所述羊膜上皮细胞的消化与刮除的具体步骤如下：
⑴羊膜上皮细胞消化液的配制：将0.4％胰蛋白酶，0.05％乙二胺四乙酸，0.027％磷酸二氢钾，0.142％磷酸氢二钠溶于1000毫升去离子水中，充分溶解后用0.22μm的过滤装置过滤除菌，4℃保存；
⑵将羊膜-硝酸纤维素膜复合体平铺于无菌培养皿中，加入配制好的羊膜上皮细胞消化液，使消化液能完全覆盖羊膜上表面
⑶将培养皿置于5％CO2培养箱中，37℃孵育30min进行羊膜上皮细胞的消化；
⑷取出培养皿，将羊膜-硝酸纤维素膜复合体从培养皿中取出，浸泡在PBS缓冲液中清洗3次，以洗净消化液；
⑸将洗净后的羊膜-硝酸纤维素膜复合体平铺在培养皿中，一手持镊子捏住羊膜-硝酸纤维素膜，一手持细胞刮刀，按同一个方向轻轻刮去羊膜上皮细胞，同时转动...

【专利技术属性】
技术研发人员：楼敏铭，马洁，冯郸，葛恒翠，
申请(专利权)人：天津市康婷生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12