本发明专利技术提供褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，从人源、猪源、鼠源或兔源组织获取，用CCK-8检测褪黑素对早衰间充质干细胞增殖能力的影响，用SA-β-Gal染色检测分析褪黑素作用于早衰间充质干细胞后SA-β-Gal染色阳性率的变化，用流式细胞术检测分析褪黑素作用于早衰间充质干细胞后细胞周期的变化，用钙结节茜素红染色，钙结节定量检测分析褪黑素对早衰间充质干细胞成骨分化能力的影响。本发明专利技术为以间充质干细胞为基础的细胞疗法防御氧化应激损伤提供了一种策略。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学应用领域，尤其涉及。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最初发现于骨髓基质中，由于其具有较强的自我更新和多向分化潜能，在组织工程和再生医学领域中已得到广泛运用。为了达到治疗目的，MSCs必须通过体外扩增得到足够的数量，然而MSCs在体外扩增却不得不面临复制衰老的命运。细胞衰老是细胞逐渐失去增殖能力，细胞周期停滞在Gl期的一种现象。此外，据报道，细胞受到氧化应激可能经历一个过早衰老的过程。早衰细胞表现出与复制衰老的细胞相同的功能特征:细胞形状变扁平、变大，丧失增殖的潜力，不可逆的细胞周期停滞，β-半乳糖肝酶(SA-f3-Gal)染色阳性率增加。更重要的是，MSCs—旦被诱导成早衰细胞，其分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、甚至非中胚层起源的细胞以及肝细胞和神经元等能力将会受到显著影响。这些阻碍MSCs在临床中的应用。活性氧(ROS)如过氧化氢(H2O2)、羟基自由基、超氧化物阴离子，会诱导氧化应激和导致DNA损伤。如果不妥善修复DNA损伤，细胞将进展到过早衰老和凋亡。中等水平的ROS对各种细胞过程至关重要，如增殖、分化。然而，在病理条件下ROS过多是有害的，会导致细胞衰老或细胞死亡。最近的研宄表明，长期细胞内H2O2的积累和接触亚致死剂量的外源性H2O2可能诱导MSCs过早衰老。 褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine)是一种主要来自松果体分泌的卩引噪胺类激素，最近被发现在骨髓中也有高水平的分泌。许多研宄表明，褪黑素调节各种生理功能，如促进睡眠、调节昼夜节律和神经内分泌活动。褪黑素有众所周知的抗氧化性能，包括清除过多的自由基和增加细胞内抗氧化酶的合成。研宄表明，褪黑素通过减少活性氧生成和提高超氧化物歧化酶产生保护细胞免受促炎性细胞因子损害。此外，褪黑素已被证明可调控终末分化细胞(关节软骨细胞)的生物功能和MSCs的多向分化。然而，褪黑素对氧化应激引起的早衰的MSCs的影响尚未阐明。
技术实现思路
解决的技术问题:针对现有的褪黑素对氧化应激引起的早衰的间充质干细胞的影响尚未阐明的缺陷，本专利技术提供一种。技术方案:本专利技术提供一种。优选的，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，从人源、猪源、鼠源或兔源组织获取。所述的间充质干细胞衰老指细胞丧失增殖能力，SA- β -Gal染色阳性率多80%，细胞周期停滞在G0/G1期比率彡80%ο所述的药物通过静脉途径或口腔途径进行给药。所述的药物的制剂形式包括液体制剂、颗粒剂、缓释剂、冲击、片剂或胶囊。所述的褪黑素的应用包括在组织工程和再生医学方面的应用。本专利技术通过测试系列浓度的H2O2对间充质干细胞衰老的影响。研宄结果表明，低浓度的H2O2,如100 μ M和200 μ Μ，诱发SA- β -gal活性，细胞周期停滞在G0/G1期，高浓度的H2O2，如400 μ M，导致细胞死亡，因此本专利技术采用100-200uM的H2O2诱导间充质干细胞早衰。本专利技术的检测内容包括:(1)褪黑素对H2O2诱导的早衰间充质干细胞增殖能力的影响；(2)褪黑素对H2O2诱导的早衰间充质干细胞SA-β -Gal染色阳性率的影响；(3)褪黑素对H2O2诱导的早衰间充质干细胞细胞周期的影响；(4)褪黑素对H2O2诱导的早衰间充质干细胞成骨分化能力的影响。上述内容通过以下技术方案予以实现: (A)骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derived MSCs，BM-MSCs)培养在完全培养基中，密度彡50%时，加入H2O2 (100-200uM)处理2_4h，制成间充质干细胞衰老模型，所述培养基组分为a-MEM和胎牛血清，它们的体积比为(4-9):1，抗生素含量为10~200 U/mL ； (B)去除H2O2后加入无血清的培养基清洗两次，加入不同浓度梯度(10nM，IuM,10uM)的褪黑素，3-5天后检测早衰间充质干细胞的增殖能力、SA-β -Gal染色阳性率、细胞周期中G0/G1期比例； (C)早衰间充质干细胞在褪黑素作用下成骨诱导14-21天后检测其成骨分化能力。上述内容的具体分析步骤如下: (1)CCK-8检测褪黑素对早衰间充质干细胞增殖能力的影响； (2)SA-β-Gal染色检测分析褪黑素作用于早衰间充质干细胞后SA-β -Gal染色阳性率的变化； (3)流式细胞术检测分析褪黑素作用早衰间充质干细胞后细胞周期的变化； (4)钙结节茜素红染色，钙结节定量检测分析褪黑素对早衰间充质干细胞成骨分化能力的影响。有益效果:本专利技术提供的，该应用具有以下有益效果，外源性补充褪黑素能够有效保护干细胞免受H2O2诱导衰老，并呈现剂量依赖的方式，表现为细胞增殖潜力增加，SA-β-gal染色阳性率降低，细胞周期中G0/G1期比率下降，成骨分化能力增强。同时，本专利技术为以间充质干细胞为基础的细胞疗法防御氧化应激损伤提供了一种策略。【附图说明】图1为褪黑素对早衰间充质干细胞增殖能力的影响检测图。图2为褪黑素作用于早衰间充质干细胞后SA-β -Gal染色阳性率的变化检测图； 图3为褪黑素作用于早衰间充质干细胞后细胞周期的变化检测图； 图4为褪黑素对早衰间充质干细胞成骨分化能力的影响检测图，用钙结节的茜素红染色(Scale bar = 200 μm)；图5为褪黑素对早衰间充质干细胞成骨分化能力的影响检测图，用钙结节定量检测。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本专利技术作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。实施例1 1、褪黑素对早衰的间充质干细胞增殖能力、SA-β-Gal染色阳性率、细胞周期的影响。人源BM-MSCs在37°C、5%C02培育箱中培养于175cm2培养瓶中(培养基各组分的体积比为89%的α -MEM, 10%的胎牛血清，1%的青霉素、链霉素)，每三天换一次液。当细胞密度彡90%时用0.25% trypsin-EDTA消化细胞，按3000/cm2接种于三种规格(96孔板用于增殖实验，12孔板用于SA- 当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何帆，周龙，刘韬，陈曦，张文，罗宗平，杨惠林，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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