人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法、通过所述方法产生的间充质干细胞以及包含间充质干细胞的细胞治疗产品。本发明专利技术的方法操作简单、便捷，只需要使用更换诱导培养基和维持培养基即可，不需要使用流式分选技术，节省费用和时间；获得的间充质干细胞纯度高、生存能力强、不容易老化，可至少传代到80代，并保持功能正常。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法、通过所述方法产生的间充质干细胞以及包含间充质干细胞的细胞治疗产品。
技术介绍
干细胞是能够分化为构成有机体组织的多种细胞的细胞，且一般指分化之前的未分化细胞，其可获自胚胎、胎儿和成人身体的各个组织。干细胞通过分化刺激分化为特定细胞；与因分化完成而引起其细胞分裂已停止的细胞不同，干细胞允许通过经由细胞分裂产生与其本身相同的细胞来进行增殖；且由于在不同环境下或通过不同的分化刺激，干细胞可分化为其它细胞，因此干细胞在分化过程中具有可塑性。干细胞根据其分化能力可分为多能(pluripotent)、多效(multipotent)和单能(unipotent)干细胞。多能干细胞为具备全能性以分化为所有细胞的多能细胞，且这些多能干细胞包含胚胎干细胞(ES细胞)以及诱导性多能干细胞(iPS细胞)等。胚胎干细胞由早期胚胎发育中胚细胞的内细胞团形成；具备全能性以分化为所有细胞从而使得其能够分化为任何种类的组织细胞；可以永生和未分化状态的形式培养；与成体干细胞不同，可通过生殖细胞的制备遗传到下一代。通过在人类胚胎形成的时候仅分离并培养内细胞团来制备人类胚胎干细胞，且当前，已从灭菌操作后剩余的冷冻胚胎中获得全局制备的人类胚胎干细胞。为使用能够分化为所有细胞的多能人类胚胎干细胞作为细胞治疗产品，已进行了各种尝试；然而，这些尝试尚未完全克服例如致癌和免疫排斥风险等高r>障碍。近来，已提供了具有免疫调节功能并且无肿瘤发生风险的间充质干细胞作为用于解决这些问题的替代方法。间充质干细胞为能够分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞等的多效细胞，且已报道具有调节免疫反应的功能。为使间充质干细胞用作细胞治疗产品，再生医学和/或细胞治疗领域所需的约1×109最少数量的细胞需得到满足。然而，在考虑用于设定条件和标准的实验时，实际需要的细胞数量进一步增加。因此，体外实验中需要至少10次传代以由获自各种来源的现有间充质干细胞提供所述量的细胞。在这种情况下，细胞变得老化并经修饰，因此，它们可能不会再适于用作细胞治疗产品。虽然已通过使用这些细胞来设定条件和标准，但可能会出现一些问题：这些细胞可能在实际用于治疗中之前就已变得枯竭，从而需要使用来自他人的间充质干细胞，且在这种情况下，由于使用不同的细胞而需要进行额外的实验。解决现有间充质干细胞培养系统的上述问题的最理想替代方法是使用人类多能干细胞或胚胎干细胞来产生间充质干细胞。然而现有的方法需要用到流式分选技术，存在着操作复杂、耗时长，生产效率低的问题。
技术实现思路
一方面，本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，本专利技术的方法能够更便捷的将不同来源的多能干细胞诱导分化为具有功能的且生存能力强的间充质干细胞。本专利技术采用的技术方案为：一种人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，包括以下步骤：1)将人诱导性多能干细胞置于Matrigel铺板的载体上，使用iPSc-MSC诱导培养基诱导所述人诱导性多能干细胞以将其转化为间充质干细胞，iPSc-MSC诱导培养基为添加有血清及L-抗坏血酸的培养基；2)以增殖性的方式培养步骤1)中得到的间充质干细胞。优选地，所述iPSc-MSC诱导培养基为添加有8-18％的血清及50-100μmol/L的L-抗坏血酸的α-MEM；所述血清为FBS。专利技术人经大量试验证明，L-抗坏血酸可有效预防间充质干细胞在传代过程中老化，iPSc-MSC诱导培养基中加入L-抗坏血酸后，得到的间充质干细胞生存能力极强。优选地，所述步骤1)中的诱导时间为14-21天。优选地，所述步骤2)通过以下步骤实施：21)消化步骤1)得到的间充质干细胞，将其传代至细胞粘合剂铺板的载体上，使用维持培养基来培养间充质干细胞，得到第一代间充质干细胞；所述维持培养基为添加有血清、bFGF以及内皮生长因子(EGF)的培养基；22)将步骤21)得到第一代间充质干细胞再次传代至细胞粘合剂铺板的载体上，使用所述维持培养基培养，得到第二代间充质干细胞；23)待第二代间充质干细胞长满后，使用所述维持培养基按正常的间充质干细胞培养方法进行培养及传代。优选地，所述维持培养基为添加有8-15％的血清、5-10ng/mL的bFGF以及10-20ng/mL的内皮生长因子的DMEM高糖培养基；所述血清为FBS。优选地，所述步骤21)中，消化是指利用消化酶消化5-15min；传代比例为1:1～1:3；培养时间为2～6d。更优选地，所述消化在37℃下进行。优选地，所述步骤22)中，传代比例为1:1～1:3。优选地，所述细胞粘合剂为明胶或Matrigel。优选地，所述载体为细胞培养板，如6孔板、12孔板等，更优选为6孔板。细胞粘合剂铺板就是将细胞粘合剂(如Gelatine或Matrigel)加入载体(如6孔板)中，每孔加700ml，37℃静置半小时，即完成铺板。正常的间充质干细胞培养方法是指传统的培养方法，即不使用细胞粘合剂(如Gelatine或Matrigel)，仅使用维持培养基对间充质干细胞进行培养。另一方面，本专利技术还提供了一种间充质干细胞，所述间充质干细胞由所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法产生。再一方面，本专利技术还提供了一种细胞治疗产品，其包括所述的间充质干细胞。又一方面，本专利技术还提供了一种用于培养细胞的饲养细胞，其包括所述的间充质干细胞。进一步地，本专利技术还提供了一种用于将人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：a.iPSc-MSC诱导培养基，其为添加有血清及L-抗坏血酸的培养基；b.维持培养基，其为添加有血清、bFGF以及内皮生长因子的培养基。优选地，所述iPSc-MSC诱导培养基为添加有8-18％的血清及50-100μmol/L的L-抗坏血酸的α-MEM；所述维持培养基为添加有8-15％的血清、5-10ng/mL的bFGF以及10-20ng/mL的内皮生长因子的DMEM高糖培养基；所述血清为FBS。在上述技术方案中，使用iPSc-MSC诱导培养基可以大大减少在分化过程中由于细胞生长过密及产生的自由基而引起诱导细胞的过早老化。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术的人诱导性多能干细胞及人胚胎干细胞诱导为间充质干细胞的方法操作简单、便本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将人诱导性多能干细胞置于Matrigel铺板的载体上，使用iPSc‑MSC诱导培养基诱导所述人诱导性多能干细胞以将其转化为间充质干细胞，iPSc‑MSC诱导培养基为添加有血清及L‑抗坏血酸的培养基；2)以增殖性的方式培养步骤1)中得到的间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，其特征在于：包
括以下步骤：
1)将人诱导性多能干细胞置于Matrigel铺板的载体上，使用iPSc-MSC诱
导培养基诱导所述人诱导性多能干细胞以将其转化为间充质干细胞，iPSc-MSC
诱导培养基为添加有血清及L-抗坏血酸的培养基；
2)以增殖性的方式培养步骤1)中得到的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，
其特征在于：所述iPSc-MSC诱导培养基为添加有8-18％的血清及50-100μmol/L
的L-抗坏血酸的α-MEM；所述血清为FBS。
3.根据权利要求1所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，
其特征在于：所述步骤1)中的诱导时间为14-21天。
4.根据权利要求1所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，
其特征在于：所述步骤2)通过以下步骤实施：
21)消化步骤1)得到的间充质干细胞，将其传代至细胞粘合剂铺板的载体
上，使用维持培养基来培养间充质干细胞，得到第一代间充质干细胞；所述维
持培养基为添加有血清、bFGF以及内皮生长因子的培养基；
22)将步骤21)得到第一代间充质干细胞再次传代至细胞粘合剂铺板的载
体上，使用所述维持培养基培养，得到第二代间充质干细胞；
23)待第二代间充质干细胞长满后，使用所述维持培养基按正常的间充质
干细胞培养方法进行培养及传代。
5.根据权利要求4所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，
其特征在于：所述维持培养基为添加有8-15％的血清、5-10ng/mL的bFGF以及
10-20ng/mL的内皮生...

【专利技术属性】
技术研发人员：付清玲，高文翔，孙悦奇，
申请(专利权)人：付清玲，
类型：发明
国别省市：广东;44