本发明专利技术涉及一种防治禽流感H5N1的重组杆状病毒疫苗的制备方法，具体涉及一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株及其制备方法，具体包含以下步骤：1)pS‑ITRs‑HA质粒的构建，2)pS‑ITRs‑HA质粒转化E.coli DH10 Bac，3)重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞，4)重组杆状病毒的扩增。制备获得的重组H5N1病毒疫苗株对免疫鸡的血清进行免疫检测，免疫鸡血清中IgG抗体的水平最高可达0.966，IL‑2、IL‑4和IFN‑γ的浓度最高可分别达到89.67ng/L、80.21ng/L和64.24ng/L，以上结果表明重组杆状病毒疫苗可有效的刺激鸡体同时产生体液免疫和细胞免疫，为鸡群提供了双重免疫保护作用，本发明专利技术为基于杆状病毒的禽流感疫苗的研发奠定理论基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种疫苗的制备方法，具体涉及一种禽流感H5N1的重组杆状病毒疫苗的制备方法。
技术介绍
禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus)对禽类及人类的威胁日益加剧，禽流感的防制越来越重要。目前，禽流感的防治主要是疫苗免疫，然而，由于H5N1亚型高致病禽流感的血清型众多、易发生抗原的变异，传统疫苗不能提供有力的保护；核酸疫苗的应用存在免疫保护期不长，制备成本高，以及安全性等制约因素，未被广泛使用。杆状病毒由于具有在宿主细胞内不复制，安全性高，蛋白表达量高等优点被广泛应用于昆虫细胞及哺乳动物细胞的转导。在真核表达系统中，杆状病毒载体系统是目前研制亚单位苗的主要工具，它是以昆虫杆状病毒为外源基因载体的表达系统，形成的重组杆状病毒可直接作为禽类疫苗对家禽进行直接免疫，且重组杆状病毒疫苗兼有活疫苗和亚单位苗的特点。但是由于杆状病毒转导哺乳动物细胞的效率及基因表达水平偏低、外源基因持续表达的时间较短，限制了杆状病毒作为禽类疫苗的应用，因此，如何提高杆状病毒的转导效率、外源基因表达效率和延长外源基因的表达时间成为研究热点。
血凝素HA作为禽流感病毒的主要保护性抗原，在其抗原性和致病性中发挥重要的作用。将H5N1型禽流感病毒HA基因克隆到由CMV启动的含有VSV-GED、WPRE、ITRs等调控元件的两组杆状病毒转移载体中，通过Bac-to-Bac系统获得重组BacmidDNA；通过对Sf9昆虫细胞的转染，收获重组杆状病毒；利用重组杆状病毒进一步侵染鸡胚成纤维细胞，检测HA基因在禽类细胞中的表达水平；将携带HA基因的重组杆状病毒直接作为疫苗进行鸡体免疫试验，将目的抗原基因高效地传递到家禽细胞中，使其有效地刺激机体产生特异性保护抗体和较强的细胞免疫应答；分析重组杆状病毒的表达时间及免疫效果，为基于杆状病毒的禽流感疫苗的研发奠定基础。
技术实现思路
为了克服上述问题，本专利技术一方面提供了一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCCNO:V201606。
本专利技术的另一方面提供了一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株，其中在病毒基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因的基因片段，所述HA基因片段的核苷酸序列为SEQIDNO：1；优选还包含启动子CMV的核苷酸序列为SEQIDNO：2、调控元件VSV-GED的核苷酸序列为SEQIDNO：3、调控元件WPRE的核苷酸序列为SEQIDNO：4和/或调控元件ITRs的核苷酸序列为SEQIDNO：5。
本专利技术再一方面还提供了一种重组H5N1病毒疫苗，其中包含根据权利要求1或2所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株作为活性成分。
本专利技术还提供了一种前述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)pS-ITRs-HA质粒的构建，
2)pS-ITRs-HA质粒转化E.coliDH10Bac，
3)重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞，
4)重组杆状病毒的扩增；
其中步骤1)包括以下步骤：
a)用PCR方法扩增鸡HA基因，并将鸡HA基因(核苷酸序列为SEQIDNO：1)连接至pMD18-T载体上得到pT-HA质粒；
b)将VSV-GED片段(核苷酸序列为SEQIDNO：3)插入pFastBac1质粒中，获得pFB-V质粒；
c)将gp64sp片段(核苷酸序列为SEQIDNO：8)插入pFB-V质粒中，获得pFB-GV质粒；
d)将ITRs-L片段(核苷酸序列为SEQIDNO：6)插入pFB-GV质粒中，获得pFB-GV-ITRs-L质粒；
e)将CMV片段(核苷酸序列为SEQIDNO：2)插入pFB-GV-ITRs-L质粒中，获得pFB-GV-ITRs-L-C质粒；
f)将WPRE片段(核苷酸序列为SEQIDNO：4)插入pFB-GV-ITRs-L-C质粒中，获得pS-ITRs-L质粒；
g)将ITRs-R片段(核苷酸序列为SEQIDNO：7)插入pS-ITRs-L质粒中，获得pS-ITRs质粒；
h)将质粒pT-HA与质粒pS-ITRs进行连接，获得pS-ITRs-HA质粒。
进一步地，所述制备方法，其中，
步骤b)是指将VSV-GED片段与pFastBac1质粒以BamHI和HindIII进行双酶切，将具有相同粘性末端的VSV-GED片段和pFastBac1连接；
步骤c)是指将gp64sp片段与pFB-V质粒进行BamHI和SalI双酶切，将具有相同粘性末端的gp64sp片段和pFB-V连接；
步骤d)是指将ITRs-L片段与pFB-GV质粒分别进行SnaBI和Bsp14070双酶切，酶切反应后将带有粘性末端的ITRs-L和pFB-GV片段进行连接；
步骤e)是指将CMV片段和pFB-GV-ITRs-L质粒进行限制性内切酶XbaI和EcoRI双酶切，将酶切反应后带有相同粘性末端的CMV和pFB-GV-ITRs-L经行连接，
步骤f)是指将pFB-GV-ITRs-L-C质粒与WPRE片段进行SalI和XhoI双酶切，将酶切反应后带有相同粘性末端的pFB-GV-ITRs-L-C和WPRE经行连接；
步骤g)是指以限制性内切酶XhoI和RsrII对质粒pS-ITRs-L和ITRs-R片段进行酶切，将具有相同末端的pS-ITRs-L和ITRs-R连接；或
步骤h)是指对质粒pT-HA与载体pS-ITRs进行SacII单酶切，将具有相同末端的pT-HA和pS-ITRs进行连接。
进一步地，步骤2)为将质粒pS-ITRs-HA加入到E.coliDH10Bac感受态细胞中，进行蓝白筛选和抗生素筛选浓度(50μg/mLKan、7μg/mLGen、10μg/mLTet)；37℃培养至可见明显的蓝、白单菌落。挑取阳性白色菌落，震荡培养后提取重组杆状病毒穿梭质粒(Bacmid)。
进一步地，步骤3)为取Sf9昆虫细胞，调整细胞密度至1-10×105个/mL，细胞贴壁培养1h后，在27℃培养细胞至72h，细胞50-99％出现感染迹象，收集P1代病毒。
重组杆状病毒BV-S-ITRs-HA作为疫苗直接免疫鸡体后，用HA蛋白刺激免疫组的鸡外周血淋巴细胞，出现了明显的淋巴细胞增殖反应。对免疫鸡只的血清进行免疫检测，免疫鸡血清中IgG抗体的水平最高可达0.966，IL-2、IL-4和IFN-γ的浓度最高可分别达到89.67ng/L、80.21ng/L和64.24ng/L，以上结果表明重组杆状病毒疫苗可有效的刺激鸡体同时产生体液免疫和细胞免疫，为鸡群提供了双重免疫保护作用，本专利技术为基于杆状病毒的禽流感疫苗的研发奠定理论基础。
本专利技术的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCCNO:V201606，分类命名为禽流感病毒H5N1亚型BV-S-ITRs-HA，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址是中国湖北省武汉市武汉大学；保藏日期为2016年1月28日。
附图说明
附图1为HA基因的PCR结果，其中M为DNAMarkerDL2000本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCC NO:V201606。
【技术特征摘要】
1.一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株，其保藏编
号为CCTCCNO:V201606。
2.一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株，其中在病
毒基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因的基因片段，所述HA基因片段的核
苷酸序列为SEQIDNO：1；优选还包含启动子CMV的核苷酸序列为SEQIDNO：
2、调控元件VSV-GED的核苷酸序列为SEQIDNO：3、调控元件WPRE的核苷
酸序列为SEQIDNO：4和/或调控元件ITRs的核苷酸序列为SEQIDNO：5。
3.一种重组H5N1病毒疫苗，其中包含根据权利要求1或2所述的表达禽流感
病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株作为活性成分。
4.一种根据权利要求1或2所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组
H5N1病毒疫苗株的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)pS-ITRs-HA质粒的构建，
2)pS-ITRs-HA质粒转化E.coliDH10Bac，
3)重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞，
4)重组杆状病毒的扩增；
其中步骤1)包括以下步骤：
a)用PCR方法扩增鸡HA基因，并将鸡HA基因(核苷酸序列为SEQIDNO：
1)连接至pMD18-T载体上得到pT-HA质粒；
b)将VSV-GED片段(核苷酸序列为SEQIDNO：3)插入pFastBac1质粒中，
获得pFB-V质粒；
c)将gp64sp片段(核苷酸序列为SEQIDNO：8)插入pFB-V质粒中，获得
pFB-GV质粒；
d)将ITRs-L片段(核苷酸序列为SEQIDNO：6)插入pFB-GV质粒中，获
得pFB-GV-ITRs-L质粒；
e)将CMV片段(核苷酸序列为SEQIDNO：2)插入pFB-GV-ITRs-L质粒
中，获得pFB-GV-ITRs-L-C质粒；
f)将WPRE片段(核苷酸序列为SEQIDNO：4)插入pFB-GV-ITRs-L-C质
粒中，获得pS-ITRs-L质粒；
g)将ITRs-R片段(核苷酸序列为SEQIDNO：7)插入pS-ITRs-L质粒中，
获得pS-ITRs质粒；
h)将质粒pT-HA与质粒pS-ITRs进行连接，获得pS-IT...
【专利技术属性】
技术研发人员：葛菁萍，平文祥，高冬妮，安琪，刘颖，白程乐，于航，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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