【技术实现步骤摘要】
本申请是国际申请号PCT/US2009/037429，国际申请日2009年3月17日，进入中国国家阶段日期为2010年11月16日，中国申请号200980117686.X，专利技术名称为“用于产生诱导的多能干细胞的组合化学遗传方法”的分案申请。对相关专利申请的交叉参考本申请要求于2008年3月17日提交的美国临时专利申请号61/069,956和于2008年10月31日提交的61/197,986的优先权利益，通过参考将其结合于此。专利技术背景干细胞通常分类为全能的或多能的。全能干细胞具有完全的分化潜力：它产生体内全部不同类型的细胞。受精卵细胞是全能干细胞的实例。多能干细胞可以在体内产生源自三个主要生殖细胞层或其胚胎的任一细胞类型。多能干细胞，诸如胚胎干细胞(ESCs)，快速增殖，同时保持多能性，即分化为多种细胞类型的能力。胚胎干细胞是对于细胞移植治疗有前景的供体来源。然而，人ESC还与关于人胚胎使用的伦理问题和异源移植后的排斥反应有关。通过直接由患者体细胞产生多能干细胞来克服这些问题是可能的。体细胞核通过与ESCs融合获得胚胎干样状态，这提示“多能性诱导”因子的存在。以前的研究近期已经显示，反转录病毒介导的将在ESCs中高度表达的四种转录因子(Oct-3/4，Sox2，KLF4和c-Myc)转染进入小鼠成纤维细胞导致诱导的多能干(iPS)细胞的产生。参见Takahashi，K.&Yama...
【技术保护点】
一种由哺乳动物非多能细胞生成诱导的多能干细胞的方法，所述方法包括：a)使所述细胞与以下至少一种相接触：抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂；L‑型Ca通道激动剂；cAMP途径活化剂；DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂；核受体配体；GSK3抑制剂；MEK抑制剂；TGFβ受体/ALK5抑制剂；HDAC抑制剂；和erk抑制剂，由此生成诱导的多能干细胞。
【技术特征摘要】
2008.03.17 US 61/069,956;2008.10.31 US 61/197,9861.一种由哺乳动物非多能细胞生成诱导的多能干细胞的方法，所述方
法包括：
a)使所述细胞与以下至少一种相接触：
抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂；
L-型Ca通道激动剂；
cAMP途径活化剂；
DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂；
核受体配体；
GSK3抑制剂；
MEK抑制剂；
TGFβ受体/ALK5抑制剂；
HDAC抑制剂；和
erk抑制剂，
由此生成诱导的多能干细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述接触步骤包括：
a)使所述细胞与以下至少两种相接触：
i.抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂；和
ii选自由以下组成的组的试剂：
L-型Ca通道激动剂；
cAMP途径活化剂；
DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂；
核受体配体；
GSK3抑制剂；
MEK抑制剂；
TGFβ受体/ALK5抑制剂；
HDAC抑制剂；和
erk抑制剂。
3.权利要求1或2的方法，其还包括：
b)将用于表达K1f多肽、Oct多肽、Myc多肽、和/或Sox多肽的一个
或多个表达盒引入所述非多能细胞中。
4.权利要求3的方法，其中将K1f4和Oct 4引入所述细胞中。
5.一种由哺乳动物非多能细胞生成诱导的多能干细胞的方法，所述方
法包括：
a)向所述非多能细胞中引入Oct多肽、K1f多肽、Myc多肽、和Sox
多肽中的一种或多种的表达或修饰Oct多肽、K1f多肽、Myc多肽、和Sox
多肽中的一种或多种的表达；
b)使所述细胞与抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂相接
触，由此生成诱导的多能干细胞。
6.权利要求5的方法，其中所述步骤a)包括使所述非多能细胞与选
自K1f多肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox多肽的一种或多种外源多肽相
接触。
7.权利要求6的方法，其中所述步骤a)包括以下至少2个循环：
i.使所述非多能细胞与选自K1f多肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox
多肽的一种或多种外源多肽相接触；
ii.随后在缺乏所述外源多肽的条件下培养所述细胞。
8.权利要求5的方法，其中所述步骤a)包括将一个或多个用于表达
K1f多肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox多肽的表达盒引入至所述非多能
细胞中。
9.权利要求5的方法，其中将用于表达Oct多肽的表达盒和用于表达
Sox多肽的表达盒引入至所述非多能细胞中。
10.权利要求5的方法，其中所述引入步骤包括向所述非多能细胞中
引入一个或多个用于表达KLF多肽和Oct多肽的表达盒，其中用于Myc
多肽和/或Sox多肽的表达盒不引入至所述细胞中。
11.权利要求5中的方法，其中所述K1f多肽是K1f4且所述Oct多肽
是Oct4。
12.权利要求5的方法，其中所述非多能细胞是体细胞。
13.权利要求5的方法，其中所述非多能细胞是成纤维细胞。
14.权利要求5的方法，其中用于表达Myc多肽的表达盒和用于表达
\tK1f多肽的表达盒均不引入至所述非多能细胞中。
15.权利要求5的方法，其中所述引入步骤在体内进行。
16.权利要求5的方法，其中所述引入步骤在体外进行。
17.权利要求5的方法，其还包括：
c)选择表现出多能干细胞特征的细胞。
18.权利要求5的方法，其中所述非多能细胞获自动物；且
所述诱导的多能干细胞分化为需要的细胞类型。
19.权利要求18的方法，其中将所述需要的细胞类型引入至所述动物
中。
20.权利要求19的方法，其中所述动物是人。
21.权利要求19的方法，其中所述动物是非人动物。
22.权利要求17的方法，其中所选择的细胞不包括用于表达Oct4的
外源表达盒。
23.权利要求5的方法，其中所述试剂抑制H3K9甲基化。
24.权利要求23的方法，其中抑制H3K9甲墓化的所述试剂是
BIX01294。
25.权利要求5的方法，其中所述细胞是人细胞。
26.权利要求5的方法，其中所述细胞是小鼠、狗、牛、猪、大鼠和
非人灵长类动物细胞。
27.权利要求5的方法，其中所述非多能细胞是祖细胞。
28.权利要求27的方法，其中所述祖细胞是神经祖细胞、皮肤祖细胞
或毛囊祖细胞。
29.权利要求5的方法，其中所述引入步骤包括引入下述：
第一载体，其包含与第一表达盒可操作相连的启动子，所述第一表达
盒包括编码K1f4的多核苷酸；
第二载体，其包含与第二表达盒可操作相连的启动子，所述第二表达
盒包括编码Sox2的多核苷酸；和
第三载体，其包含与第三表达盒可操作相连的启动子，所述第三表达
盒包括编码c-Myc的多核苷酸。
30.权利要求5的方法，其中所述载体是反转录病毒质粒、慢病毒质
\t粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体。
31.一种筛选诱导哺乳动物细胞重编程或去分化成为多能干细胞的试
剂的方法，所述方法包括：
a)将Oct多肽、K1f多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的至少一种，但
非全部引入至非多能细胞中，以产生转染的细胞；
b)使所述转染的细胞与不同试剂的文库相接触；
c)针对多能干细胞特征筛选所接触的细胞；和
d)使干细胞特征的形成与来自所述文库的特定试剂相关联，由此鉴定
刺激细胞去分化成为多能干细胞的试剂。
32.权利要求31的方法，其中步骤a)包括将一个或多个用于表达Oct
多肽、K1f多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的至少一种，但非全部的表达
盒引入至所述非多能细胞中。
33.权利要求31的方法，其中步骤a)包括将外源Oct多肽、外源K1f
多肽、外源Myc多肽、和外源Sox多肽中的至少一种，但非全部引入至
所述非多能细胞中。
34.权利要求31的方法，其中所述特定试剂在50-1500道尔顿之间。
35.权利要求31的方法，其中步骤a)包括将两个表达盒引入所述细
胞，其中每个表达盒包括编码不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白选自由
Oct多肽、K1f多肽、Myc多肽、和Sox多肽组成的组，且所述组的其余
成员不引入至所述细胞内。
36.权利要求31的方法，其中步骤a)包括将三个表达盒引入所述细
胞，其中每个表达盒包括编码不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白选自由
Oct多肽、K1f多肽、Myc多肽、和Sox多肽组成的组，且所述组的其余
成员不引入至所述细胞内。
37.权利要求31的方法，其中所述细胞是人细胞。
38.权利要求31的方法，其中所述细胞是非人哺乳动物细胞。
39.权利要求31的方法，其中所述非多能细胞是祖细胞。
40.权利要求40的方法，其中所述祖细胞是神经祖细胞、皮肤祖细胞
或毛囊祖细胞。
41.权利要求31的方法，其中所述Oct多肽是Oct4，所述K1f多肽是
\tK1f4，所述Myc多肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
42.一种筛选具有多能干细胞特征的哺乳动物细胞的方法，所述方法
包括：
a)使细胞与MAPK/ERK激酶(MEK)抑制剂相接触，从而抑制非多能
细胞生长并促进多能干细胞生长；和
b)针对多能干细胞特征筛选所接触的细胞。
43.权利要求42的方法，其包括：
在步骤a)之前，使所述细胞与试剂文库相接触；
和，在步...
【专利技术属性】
技术研发人员：师岩，卡罗琳·德蓬，丁生，周宏彦，林通翔，李文林，朱赛勇，
申请(专利权)人：斯克里普斯研究所，
类型：发明
国别省市：美国;US
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