多能细胞的诱导制造技术

用于产生人诱导多能干细胞(iPSC)的重编程序方法的缓慢动力学和低效率对它们在生物医学应用中的实用性产生重大限制。我们在这里描述了一种化学方法，其在处理7天内，显著提高(>200倍)从人成纤维细胞产生iPSC的效率。这将为开发更安全的、更有效的、非病毒性的对人的体细胞重编程序的方法提供基础。体细胞重编程序的方法提供基础。体细胞重编程序的方法提供基础。

【技术实现步骤摘要】
多能细胞的诱导
[0001]本申请是申请日2010年10月15日，中国申请号201610220657.8，专利技术名称为“多能细胞的诱导”的专利申请的分案申请。
[0002]对相关申请的交叉引用
[0003]本申请根据35 U.S.C.
§
1.119(e)要求2009年10月16日提交的美国临时申请号61/252,548的权益，该美国临时申请的内容通过引用整体并入。

技术介绍

[0004]产生人诱导多能干细胞(iPSC)的最新进展(Takahashi,K.等,Cell 131,861
‑
72(2007)；Yu,J.等,Science 318,1917
‑
20(2007)；Muller,L.U.W.,等,Mol.Ther.17,947
‑
53(2009))，已经唤起了它们在生物医学研究和临床应用中实用的希望。但是，iPSC产生仍然是非常慢的(约4周)且低效的(<0.01％(Takahashi,K.等,Cell 131,861
‑
72(2007)；Yu,J.等,Science 318,1917
‑
20(2007))过程，该过程产生异质细胞群体。从这样的混合物中鉴别出完全重编程序的(reprogrammed)iPSC是使人厌烦的，且需要在人多能细胞培养方面的专门技能。
[0005]尽管正在克服外源性重编程序因子的基因组插入的危险，但是重编程序的低效率和缓慢动力学继续代表着人iPSC的最终应用的难克服的问题。例如，在重编程序过程中，可能发生遗传的或后生的异常的增加，其中肿瘤抑制因子可能被抑制，致癌途径可能被激活。尽管最近的研究已经报道，除了最初的4种因子以外，通过遗传操作来提高重编程序的效率(Feng,B.等,Cell Stem Cell 4,301
‑
12(2009))，但是这样的操作通常使得该过程甚至更复杂，并会增加遗传改变和致瘤性的风险。因而，仍然存在对更安全的、更容易的且更有效的人iPSC生产以及促进对重编程序的基本机理的鉴定和表征的方法的巨大需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了混合物(例如，可用于诱导iPSC)。在一些实施方案中，所述混合物包含：
[0007]哺乳动物细胞；
[0008]TGFβ受体/ALK5抑制剂；
[0009]MEK抑制剂；和
[0010]Rho GTP酶/ROCK途径抑制剂。
[0011]在一些实施方案中，至少99％的细胞是非多能细胞。在一些实施方案中，所有或基本上所有的细胞是非多能细胞。
[0012]在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。
[0013]在一些实施方案中，所述TGFβ受体/ALK5抑制剂是SB431542。
[0014]在一些实施方案中，所述MEK抑制剂是PD0325901。
[0015]在一些实施方案中，所述ROCK抑制剂是具有下式的化合物：
[0016][0017]环A是取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、或取代的或未取代的杂芳基；
[0018]环B是取代的或未取代的杂环烷基、或取代的或未取代的杂芳基；
[0019]L1是
‑
C(O)
‑
NR2‑
或
‑
C(O)
‑
NR2‑
；
[0020]L2是键、取代的或未取代的亚烷基、或取代的或未取代的杂亚烷基；和
[0021]R1和R2独立地是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、或取代的或未取代的杂芳基。
[0022]在一些实施方案中，所述ROCK抑制剂具有下式：
[0023][0024]其中，y是0
‑
3的整数；z是0
‑
5的整数；X是
‑
N＝、
‑
CH＝或
‑
CR5＝；R3、R4和R5独立地是CN、S(O)
n
R6、NR7R8、C(O)R9、NR
10
‑
C(O)R
11
、NR
12
‑
C(O)
‑
OR
13
、
‑
C(O)NR
14
R
15
、
‑
NR
16
S(O)2R
17
、
‑
OR
18
、
‑
S(O)2NR
19
、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、或取代的或未取代的杂芳基，其中n是0
‑
2的整数，其中如果z大于1，则2个R3部分任选地连接到一起，以形成取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、或取代的或未取代的杂芳基；且R6、R7、R8、R9、R
10
、R
11
、R
12
、R
13
、R
14
、R
15
、R
16
、R
17
、R
18
和R
19
独立地是氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、未取代的环烷基、取代的或未取代的杂环烷基、取代的或未取代的芳基、或取代的或未取代的杂芳基。
[0025]在一些实施方案中，所述ROCK抑制剂具有下式：
[0026][0027][0028]在一些实施方案中，所述ROCK抑制剂是
[0029][0030]在一些实施方案中，其中当使所述混合物处于足以诱导所述混合物中的非多能细胞转化成诱导多能干细胞的条件下时，所述抑制剂的浓度足以使将所述细胞诱导成诱导多能干细胞的效率提高至少10％。
[0031]在一些实施方案中，所述混合物另外包含GSK3抑制剂和/或HDAC抑制剂。
[0032]在一些实施方案中，所述多肽选自：Oct
‑
3/4,Sox2,KLF4和c
‑
Myc。在一些实施方案中，所述细胞选自：人细胞、非人动物细胞、小鼠细胞、非人灵长类动物或其它动物细胞。
[0033]本专利技术也提供了将非多能哺乳动物细胞诱导成诱导多能干细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括，在足以诱导至少一些细胞变成多能干细胞的条件下，使非多能细胞接触：
[0034]TGFβ受体/ALK5抑制剂；
[0035]MEK抑制剂；和
[0036]ROCK抑制剂。
[0037]在一些实施方案中，所述条件包括：将至少一种外源性转录因子导入非多能细胞中。在一些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组合物，其包含：ALK5抑制剂；MAP/ERK激酶(MEK)抑制剂；Rho激酶(ROCK)抑制剂，其中与用ALK5抑制剂和MEK抑制剂而无ROCK抑制剂处理的非多能哺乳动物细胞相比，所述ALK5抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂以有效增加将非多能哺乳动物细胞重编程为多能细胞的效率的量存在。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述MEK抑制剂是PD0325901。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述ALK5抑制剂是A
‑
83
‑
01或SB431542。4.根据权利要求1所述的组合物，其还包含(i)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂；或(ii)组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。5.根据权利要求1所述的组合物，其还包含一种或多种非多能哺乳动物细胞，其中所述非多能哺乳动物细胞包含选自由Oct
‑
3/4、Klf、Sox2和c
‑
Myc组成的组的一种或多种外源转录因子。6.一种将非多能哺乳动物细胞诱导成诱导多能干细胞的体外方法，所述方法包括：在足以诱导多能干细胞的条件下，将包含Oct
‑
3/4和任选地Klf、Sox2和c
‑
Myc中的一种或多种的外源转录因子导入所述非多能细胞中；和使所述非多能细胞接触权利要求1
‑
4中任一项所述的组合物。7.根据权利要求6所述的方法，其中将所述外源转录因子导入所述非多能细胞中包括：将编码所述外源转录因子的一种或多种多核苷酸导入所述非多能细胞中。8.根据权利要求6所述的方法，其中将所述外源转录因子导入所述非多能细胞中包括：使所述非多能细胞接触多肽，其中所述多肽包含所述外源转录因子的氨基酸序列。9.根据权利要求6所述的方法，其中将所述外源转录因子导入所述非多能细胞中包括导入Oct
‑
3/4,Klf,Sox2,和任选的c
‑
Myc。10.一种混合物，其包含：一种或多种哺乳动物细胞；ALK5抑制剂；MAP/ERK激酶(MEK)抑制剂；GSK3抑制剂；和Rho激酶(ROCK)抑制剂。11.根据权利要求10所述的混合物，其中所述ROCK抑制剂具有以下结构：其中，L2是未取代的C1‑
C
10
亚烷基；
y是0
‑
1的整数；z是0
‑
1的整数；X是
‑
N＝或
‑
CH＝；R1是氢或未取代的C1‑
C6烷基；R3是
‑
OR
18
，或取代的或未取代的C1‑
C6烷基，其中所述取代的C1‑
C6烷基是用卤素取代的；R4是
‑
OR
18
；且R
18
是氢或未...

【专利技术属性】
技术研发人员：林通翔，丁生，
申请(专利权)人：斯克里普斯研究所，
类型：发明
国别省市：