利用miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用miR

【技术实现步骤摘要】
利用miR
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212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法


[0001]本专利技术属于细胞工程以及基因工程
，具体涉及一种利用 miR
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212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法。

技术介绍

[0002]卵泡颗粒细胞是卵泡发育和维持正常功能的重要条件，对维持卵 巢繁殖功能发挥着极其重要的作用。有研究者发现，卵泡闭锁退化的 过程是由卵泡中颗粒细胞的凋亡触发的，颗粒细胞的凋亡最终会导致 卵泡的闭锁。在卵泡颗粒细胞中可以分泌类固醇激素、促卵泡素和促 黄体素等激素，还可以产生一些细胞因子(孕酮、干细胞生长因子和 表皮生长因子等)，调控着卵泡和卵母细胞的生长发育。
[0003]在生猪生产中仔猪的出生率与生产的经济效益显著正相关，如何 提高产子数在现代猪遗传育种工作中都扮演至关重要的角色。目前对 于提高母猪产子数主要依赖遗传辅助标记选择，对于标志基因纯合或 杂合个体的筛选以及与产子性能较好的猪种如太湖猪等杂交育种，除 此之外暂无极为显著的提高方法。然而，母猪的产子数还与卵泡的发 育相关，卵巢颗粒细胞直接影响卵泡的发育，因此探究影响卵巢颗粒 细胞增殖的条件在生产实践中对于促进卵泡发育、排卵具有重要意义。
[0004]miRNA是一类长度22nt左右的小分子绝大多数不具备编码能力 的小分子RNA，主要依赖于2
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8位的种子序列与编码基因的3
’
端非 翻译区相结合，从而沉默复合靶基因发挥生物学功能。大量研究表明miRNA在调控卵泡发育、闭锁等生物过程中扮演重要角色，并且在 卵巢癌症等相关领域也有大量报道。然而，如何利用miRNA调控卵 巢颗粒细胞的增值，目前仍待研究。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的缺点和需求，本专利技术的目的在于提供一种利用 miR
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212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供的方案如下：
[0007]将miR
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212转染入卵巢颗粒细胞中。
[0008]作为本专利技术的优选技术方案，在进行所述转染前，还包括分离、 接种、传代培养和收样操作。
[0009]作为本专利技术的一个实施方案，所述巢颗粒细胞为猪卵巢颗粒细胞。
[0010]作为本专利技术的一个实施方案，进行所述分离操作时，按照如下方 法进行：
[0011]1)于母猪屠宰后取出卵巢，置于PBS中清洗后，将卵巢保存在 38摄氏度的生理盐水中于1小时内分离卵巢颗粒细胞；
[0012]2)将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后，用手术刀 将卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破，收集卵泡液，将吸取后的卵 泡液放入15ml离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清，用预热的PBS 轻轻吹打均匀清洗离心重复两次；
[0013]3)配制的卵巢颗粒细胞培养液为20％FBS加DMEM以及1％的 抗生素。
[0014]作为本专利技术的一个实施方案，在进行接种前，待卵巢颗粒细胞增 殖到85％后，弃掉原培养基，用PBS清洗两次后用巴氏吸管加入1ml 胰酶，放入37度细胞培养箱，放置2min后加入新鲜培养基终止消化， 将细胞吹打下来，将悬液吸入15ml离心管；最终将细胞用培养液冲 匀接种到12孔板中进行培养。
[0015]作为本专利技术的一个实施方案，在细胞转染前一天，将处于细胞接 种至12孔培养板中，当增殖细胞密度达到35～45％时，进行转染，48 小时候后收样。
[0016]作为本专利技术的优选实施方案，在进行转染时，按照 lipofectamine3000试剂盒的说明书进行。
[0017]作为本专利技术的优选实施方案，所述抗生素为青霉素、链霉素和两 性霉素。
[0018]作为本专利技术的优选实施方案，进行所述收样时，将RNAisoPlus 加入每个孔，裂解一分钟后反复吹打吸出，并将样品于
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80℃下保存。
[0019]作为本专利技术的优选实施方案，在步骤(2)中，细胞密度培养到 40％。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021]本专利技术提供了一种显著的调控卵巢颗粒细胞的增值，本专利技术方法 简单、易于实施推广。本专利技术的研究表明，通过对猪卵巢颗粒细胞进 行分离、培养，转染miR
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212后显著促进颗粒细胞的增殖能力，为后 续卵泡发育相关研究提供理论基础。
附图说明
[0022]图1为miR
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212二级结构
[0023]图2为本专利技术转染效率实验结果图；
[0024]图3为对卵巢颗粒细胞转染mimics inhibitor mimics NC，inhibitor NC 加入CCK试剂检测细胞增殖情况实验结果图；
[0025]图4为对卵巢颗粒细胞转染mimics inhibitor mimics NC，inhibitor NC 检测CyclinD基因表达量实验结果图；
[0026]图5对卵巢颗粒细胞转染mimics inhibitor mimics NC，inhibitor NC 检测CyclinE基因表达量实验结果图；
[0027]图6为使用双荧光素酶报告系统检测miR
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212与FGF16的靶标关系 图；
[0028]图7为对卵巢颗粒细胞转染FGF16 siRNA干扰其表达后检测CyclinD 基因表达量实验结果图；
[0029]图8为对卵巢颗粒细胞转染FGF16 siRNA干扰其表达后检测P53蛋 白表达量实验结果图。
具体实施方式
[0030]下面通过实施例对本专利技术进行具体描述，有必要在此指出的是以 下实施例只是用于对本专利技术进行进一步的说明，不能理解为对本专利技术 保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述
技术实现思路
所做出的 一些非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。
[0031]实施例1
[0032]一、实验方案
[0033]1.猪卵巢颗粒细胞分离及培养
[0034]于母猪屠宰后取出卵巢，置于PBS中清洗后，将卵巢保存在38 摄氏度的生理盐水中于1小时内带回实验室分离卵巢颗粒细胞。
[0035]将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后，用手术刀将 卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破，收集卵泡液，将吸取后的卵泡 液放入15ml离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清，用预热的PBS 轻轻吹打均匀清洗离心重复两次。
[0036]配制的卵巢颗粒细胞培养液为20％FBS加DMEM以及1％三抗 (青霉素、链霉素和两性霉素)
[0037]2.细胞接种、传代、转染、收样
[0038]待卵巢颗粒细胞增殖到85％弃掉原培养基，用PBS清洗两次后 用巴氏吸管加入1ml胰酶，放入37度细胞培养箱，2min后，加入新 鲜培养基终止消化，将细胞吹打下来，将悬液吸入15ml离心管。最 终将细胞用培养液冲匀接种到12孔板中进行培养。细胞转染前一天， 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用miR
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212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将miR
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212转染入卵巢颗粒细胞中。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行所述转染前，还包括分离、接种、传代培养和收样操作。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巢颗粒细胞为猪卵巢颗粒细胞。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进行所述分离操作时，按照如下方法进行：1)于母猪屠宰后取出卵巢，置于PBS中清洗后，将卵巢保存在38摄氏度的生理盐水中于1小时内分离卵巢颗粒细胞；2)将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后，用手术刀将卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破，收集卵泡液，将吸取后的卵泡液放入15ml离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清，用预热的PBS轻轻吹打均匀清洗离心重复两次；3)配制的卵巢颗粒细胞培养液为20％FBS加DMEM以及1％的抗生素。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张锫文，朱砺，张顺华，沈林園，牛丽莉，赵叶，陈蕾，郭鑫宇，吴霜，李欣荣，肖茜，林许韬，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：