用于产生和调节iPS细胞的方法及其组合物技术

本发明专利技术提供了产生诱导的多能干（iPS）细胞的方法，其与常规方法相比具有提高的诱导效率。所述方法包括：用与改变所述细胞中的微RNA水平或活性的试剂和/或p21抑制剂组合的细胞核重新程序化因子处理体细胞。本发明专利技术另外提供了通过这样的方法产生的iPS细胞以及这样的iPS细胞的临床和研究用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分化过程中表现出活性或表达的增加或减少。在一个方面，诱导效率是没有所述试剂时的至少2倍。在另一个方面，诱导效率是没有所述试剂时的至少3倍。在另一个方面，诱导效率是没有所述试剂时的至少5倍。在一个方面，所述微RNA可以是miR-17、miR-25、miR-106a或 miR-302b 簇中的一种或多种微 RNA，包括 miR-93、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-let-7家族成员(例如，let-7a;miR 98)或它们的组合。在一个有关的方面，所述微RNA具有包含SEQ ID NO: I的多核苷酸序列，该序列已经被确定在不同的微RNA (例如，SEQ ID N0:2-ll的那些，它们对应着在miR-17、miR-25、miR-106a和miR_302b簇内的微RNA种类)之间是保守的。在一个方面，所述微RNA具有选自SEQ ID NO:2-11的多核苷酸序列。在不同的方面，所述细胞核重新程序化因子由在导入所述细胞中的重组载体中包含的基因编码。在另一个方面，所述试剂抑制p21、Tgfbr2, p53或它们的组合的表达或活性。在另一个方面，所述试剂调节Spry 1/2、p85、CDC42或ERK1/2途径。在不同的方面，所述细胞核重新程序化因子由下述基因中的一个或多个编码S0X家族基因、KLF家族基因、MYC家族基因、SALL4、0CT4、NAN0G、LIN28或它们的组合。在一个示例性的方面，所述细胞核重新程序化因子是0CT4、S0X2、KLF4、C-MYC中的一种或多种。在另一个方面，所述至少一种细胞核重新程序化因子包括c-Myc。在另一个方面，c-Myc通过抑制至少一种miRNA至少部分地增强重新程序化。在另一个实施方案中，本专利技术提供了 iPS细胞或使用本文所述的方法产生的这种细胞的群体。在另一个实施方案中，本专利技术提供了通过本文所述的方法产生的诱导的多能干(iPS)细胞的富集群体。类似地，在另一个实施方案中，本专利技术提供了通过诱导使用本文所述的方法产生的iPSC的分化而衍生出的分化的细胞。在一个方面，通过如下诱导分化而衍生出所述体细胞使所述iPSC接触RNA分子或反义寡核苷酸。在一个方面，所述RNA分子选自微RNA、dsRNA、siRNA、stRNA 或 shRNA。在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种使用通过本文所述的方法制备的iPS细胞治疗受试者的方法。所述方法包括使用本文所述的方法，将受试者的体细胞诱导成诱导的多能干(iPS)细胞，诱导所述iPS细胞的分化，以及将所述分化的细胞导入受试者中，从而治疗病症。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种用于评价试剂的生理功能的方法，其中使用通过本文所述的方法产生的iPS细胞或它们的来源体细胞。在一个方面，所述方法包括处理使用本文所述的方法产生的诱导的多能干(iPS)细胞，以及评价由所述试剂引起的至少一种细胞功能的变化。在另一个方面，所述方法包括用试剂处理分化的细胞，所述细胞通过诱导本文所述的多能干细胞的分化而衍生出，以及评价由所述试剂引起的细胞功能的变化。在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种评价化合物的毒性的方法，其中使用通过本文所述的方法产生的iPS细胞或它们的来源体细胞。在一个方面，所述方法包括用所述化合物处理使用本文所述的方法产生的诱导的多能干(iPS)细胞，以及评价所述化合物的毒性。在另一个方面，所述方法包括用所述化合物处理分化的细胞，所述细胞通过诱导本文所述的多能干细胞的分化而衍生出，以及评价所述化合物的毒性。在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种产生诱导的多能干(iPS)细胞的方法。所述方法包括使体细胞接触至少一种细胞核重新程序化因子；以及使所述细胞接触P21、Tgfbr2、p53的或它们的组合的表达或活性的抑制剂。在一个方面，所述抑制剂抑制p21的表达和/或活性。在另一个方面，所述抑制剂抑制Tgfbr2的表达和/或活性。在另一个方面，所述抑制剂抑制P53的表达和/或活性。在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种产生诱导的多能干(iPS)细胞的方法。所述方法包括使体细胞接触改变所述细胞内的RNA水平或活性的试剂，其中所述试剂诱导体细胞的多能性，条件是，所述试剂不是细胞核重新程序化因子，从而产生iPS细胞。在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种治疗受试者的方法。所述方法包括通过本文所述的方法，从受试者的体细胞产生诱导的多能干(iPS)细胞；诱导iPS细胞的分化；以及将所述细胞导入受试者中，从而治疗病症。在另一个实施方案中，本专利技术提供了微RNA用于提高iPS细胞的产生效率的用途。在一个方面，所述微 RNA 选自miR-17、miR-25、miR-93、miR_106a、miR_106b、miR-21、 miR-29a、miR-302b簇或它们的组合。在另一个方面，所述微RNA是在miR-17、miR-25、miR-106a 或 miR-302b 簇中。在另一个方面，所述微 RNA 是 miR-93、miR_106b、miR-21、miR-29a或它们的组合。在另一个实施方案中，本专利技术提供了选自下述的miR序列的组合miR-17、miR-25、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-302b 簇、miR let-7 家族成员或它们的组合。在另一个方面，所述微RNA是在miR-17、miR-25、miR-106a*miR-302b簇中。在另一个方面，所述微RNA是miR-93、miR_106b、miR-21、miR_29a或它们的组合。附图说明图I显示了 RNAi机制在小鼠iPSC诱导中的涉入。图la、lb和Ic分别图解了shRNA 对小鼠 RNAi 机制基因 Ago2、Drosha 和 Dicer 的敲除(knock-down)。通过 RT-qPCR(如在直方图中所示)和对应的蛋白印迹，分析了靶向的基因的mRNA和蛋白水平。用4种因子+靶向Drosha、Dicer和Ago2的shRNA转导原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。用慢病毒shRNA+4 ug/U I聚凝胺转导MEF，并在转导后第3天收获总RNA或蛋白。分别通过RT-qPCR和蛋白印迹法，分析靶向的基因的mRNA和蛋白水平。pLKO是shRNA慢病毒载体的空载体对照。pGIPZ是表达非靶向shRNA的慢病毒载体。图Id表明，Ago2的敲除会减少OSK的iPSC诱导。将集落染色，并在转导后第21天定量AP。误差棒代表来自一式两份的孔的标准差。图Ie显示了具有shAgo2的iPSC的GFP+集落定量。在转导后第21天定量GFP+集落。误差棒代表来自一式两份的孔的标准差。图If表明，Ago2的敲除会急剧减少4F的iPSC诱导。用4种重新程序化因子(OSKM (4F))+shRNA Ago2转导原代MEF。可以在转导后第14天对集落进行碱性磷酸酶染色，所述碱性磷酸酶是mES/iPS细胞的标志物。pLKO和pGIPZ载体充当阴性对照。图2显示了在重新程序化的早期，微RNA簇miR_17、25、106a和302b的诱导。图2a显示的图解表示描绘了在4种因子转导以后的早期，10个微RNA簇的表达诱导。使用miR RT-qPCR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.11 US 61/260,3301.一种产生诱导的多能干(iPS)细胞的方法，所述方法包括 a)使体细胞接触细胞核重新程序化因子；以及 b)使(a)的所述细胞接触改变所述细胞内的RNA水平或活性的微RNA，从而产生iPS细胞。2.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA或RNA经过修饰。3.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA是在载体中。4.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA是在miR-17、miR-25、miR_106a、miRlet-7家族成员或miR_302b簇中。5.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA是miR-93、miR-106b、miR-21、miR-29a或它们的组合。6.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA具有包含SEQIDNO: I的多核苷酸序列。7.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA具有选自SEQIDNO:2-11的多核苷酸序列。8.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA调节p21、Tgfbr2、p53或它们的组合的表达或活性。9.根据权利要求I所述的方法，其中所述微RNA调节Spry1/2、p85、CDC42或ERK1/2途径。10.根据权利要求I所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子由在载体中包含的基因编码。11.根据权利要求I所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子是SOX家族基因、KLF家族基因、MYC家族基因、SALL4、0CT4、NANOG, LIN28或它们的组合。12.根据权利要求I所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子是0CT4、S0X2、KLF4、C-MYC中的一种或多种。13.根据权利要求I所述的方法，其中所述细胞核重新程序化因子包括c-Myc。14.根据权利要求I所述的方法，其中在接触所述微RNA之前、同时或之后，使所述体细胞接触所述重新程序化因子。15.根据权利要求I所述的方法，其中所述体细胞是哺乳动物细胞。16.一种使用根据权利要求I所述的方法产生的诱导的多能干(iPS)细胞。17.一种根据权利要求I所述的方法产生的诱导的多能干(iPS)细胞的富集群体。18.—种通过诱导根据权利要求I所述的方法产生的多能干细胞的分化而衍生出的分化的细胞。19.一种治疗受试者的方法，所述方法包括 a)通过根据权利要求I所述的方法，从所述受试者的体细胞产生诱导的多能干(iPS)细胞； b)诱导步骤(a)的所述iPS细胞的分化；以及 c)将(b)的所述细胞导入所述受试者中，从而治疗病症。20.微RNA用于提高iPS细胞的产生效率的用途。21.根据权利要求20所述的用途，其中所述微RNA选自:miR-17、miR-25、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-302b 簇、miR let-7 家族成员或它们的组合。22. miR序列的一种组合,其选自下述的至少2种或更多种miR_17、miR-25、miR-93、miR-106a、miR-106b、miR-21、miR-29a、miR-302b 簇、miR let-7 家族成员或它们的组合。用于产生和调节i PS细胞的方法及其组合物技术领域本发明一般地涉及诱导的多能干(iPS)细胞领域，更具体地涉及从体细胞产生这样的细胞的方法以及通过这样的方法产生的iPS细胞的临床和研究用途。技术背景诱导的多能干细胞(iPSC)表现出胚胎干(ES)细胞的性质，最初通过4种细胞核重新程序化因子(4F:0ct4、Sox2、Klf4和cMyc)在小鼠体细胞中的异位表达来产生。在人细胞中，除了最初的4种Yamanaka因子以外，iPSC也可以用4种因子的替代集合(例如，0ct4Nanog Lin28和Sox2)来产生。尽管已经证实来自不同组织的许多细胞类型是可重新程序化的，iPSC衍生化和进一步的治疗用途的主要瓶颈是，重新程序化的低效率，通常0. 01%至0.2%。尽管大量工作已经聚焦于筛选提高重新程序化效率的小分子以及开发iPSC衍生化的新方法，原代成纤维细胞如何重新程序化为ES-样状态的机制在很大程度上仍然不明。为了理解细胞重新程序化的机制，已经使用了不同的方案。基于小分子的方法已经鉴定出，通过用Dnmtl抑制剂处理细胞，可以加速重新程序化过程。还已经发现，TGF3抑制能够更快地且更有效地诱导iPSC，其可以替代Sox2和cMyc。进一步的阵列分析已经证实，当提供用诸如甲基转移酶抑制剂等因子的处理时，可以推动部分地重新程序化的iPSC进一步变成完全重新程序化的。4种重新程序化因子的启动子结合和表达诱导的基因组范围的分析证实，这些因子在iPSC和mES细胞中具有类似的靶标，且可能调节类似的基因集合，并且重新程序化因子的靶向在部分的iPSC中也被改变。最近，几个研究组已经鉴定出，P53-介导的肿瘤...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·M·拉那，
申请(专利权)人：桑福德—伯恩哈姆医学研究协会，
类型：发明
国别省市：