树突状杀手细胞的鉴定与筛选方法技术

本发明专利技术提供一种树突状杀手细胞的鉴定方法，涉及鉴定多个选自由HLA-G-、CD14-,CD3-,CD19-,CD56dim与HLA-DR+所组成的群组的细胞表面标记。同时，本发明专利技术还提供一种从人类外围血单核球细胞中筛选出树突状杀手细胞的方法，上述筛选方法至少包含下列步骤。首先，提供第一细胞群组，并检测第一细胞群组中CD14与HLA-G的表现以分选出第二细胞群组。接着，检测第二细胞群组中CD19与CD3的表现以分选出第三细胞群组。最后，检测第三细胞群组中HLA-DR与CD56的表现以得到树突状杀手细胞群组。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种树突状杀手细胞的鉴定方法，涉及鉴定多个选自由HLA-G-、CD14-,CD3-,CD19-,CD56dim与HLA-DR+所组成的群组的细胞表面标记。同时，本专利技术还提供一种从人类外围血单核球细胞中筛选出树突状杀手细胞的方法，上述筛选方法至少包含下列步骤。首先，提供第一细胞群组，并检测第一细胞群组中CD14与HLA-G的表现以分选出第二细胞群组。接着，检测第二细胞群组中CD19与CD3的表现以分选出第三细胞群组。最后，检测第三细胞群组中HLA-DR与CD56的表现以得到树突状杀手细胞群组。【专利说明】
本专利技术涉及一种树突状杀手细胞的鉴定及筛选方法，主要是利用不同群组的细胞拥有不同的表面标记的特性，进而分选细胞群组，最后从人类外围血单核球细胞中筛选出细胞表面标记为HLA_G_CD14_CD19_CD3_CD56diniHLA-DR+的树突状杀手细胞的方法。
技术介绍
人体对外来异物具有辨识和启动一连串反应的防御机转，这防御系统就是免疫系统。免疫系统拥有不同作用的细胞，如白血球及淋巴细胞、不同功能的蛋白质因子，如免疫球蛋白、介白质及细胞激素等，互相协调合作，形成人体的防御力。免疫反应依其特异性及记忆性的有无，分为先天性及后天性。先天性免疫系统包括可溶性化学因子、干扰素、补体系统、嗜中性淋巴球及巨噬细胞的吞噬作用和自然杀手细胞的毒杀作用等。后天性免疫系统包括体液免疫及细胞免疫，前者包括抗体生成系统，后者包括淋巴细胞、淋巴激素及免疫记忆系统。记忆的功能使免疫系统对已对付过的抗原，引发强而快速的次发反应，可将外来危害因子有效去除。免疫反应对抗原会有不同反应是由于主要组织兼容复合物(MajorHistocompatibility Complex, MHC)的作用。外来抗原通常需要经过细胞处理与MHC分子结合后，才能被免疫系统所认知。因此MHC的类型与个人对特定因子的免疫力有关，是造成个体对疾病易感性的重要因素。人类的MHC又名人类白血球抗原(Human LeukocyteAntigen, HLA)。HLA可分为class 1、class II,为结构相似的醣蛋白，与抗原呈现功能有关。HLA class I抗原表现于所有体细胞上，而class II只表现于巨噬细胞、B细胞及树突状细胞(Dendritic Cell, DC)的细胞表面上。 人体内有一种高度分化的免疫细胞，叫做抗原呈现细胞(Antigen PresentingCells, APC)。抗原呈现细胞的功能是摄取、加工、处理外源性抗原并将加工后抗原呈现给T淋巴细胞，诱导T淋巴细胞进行增殖进而分化成效应细胞，产生免疫反应，以辨识并抵抗感染甚至癌症细胞。树突细胞(Dendritic cells, DCs)是目前所知的人体内功能最强大的抗原呈现细胞，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC的最大特点是能够显著刺激初始T细胞进行增殖，而其他的抗原呈现细胞，如巨噬细胞、B细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞。因此DC是机体免疫反应的始动者,在免疫反应的诱导中具有独特的地位。另外，自然杀手细胞(Natural Killer cell, NK cell)也是一种在免疫反应中占有重要地位的细胞，其起源于淋巴前驱细胞，占人类血液中淋巴球的5~10%。NK细胞表面缺乏专一性的抗原受体，负责非专一性防御，可以胞杀肿瘤细胞和被病毒感染细胞。NK细胞表面虽然没有抗原专一性受体，但其表面有许多其他的膜蛋白接受来自目标细胞的刺激，以调节NK细胞的活性，这些膜蛋白大致可分为“抑制性受体”和“活化性受体”。当NK细胞与细胞接触后，获得活化性受体的讯息，若与正常细胞接触，则正常细胞表面的第一型MHC分子与抑制性受体结合，传递了 “抑制” NK细胞活性的讯息，故NK细胞不会被活化，以避免杀死正常细胞。若正常细胞被病毒感染或转为肿瘤细胞后，第一型MHC分子的表现常会发生异常，因此当NK细胞接触不正常细胞时，便无法获得抑制性受体的讯息，于是NK细胞便活化进行胞杀作用。也就是说，只有“活化”讯息存在，且“抑制”的讯息异常或不存在时，NK细胞才会进行胞杀作用。近年来，同时具有上述两种DC与NK细胞功能的干扰素分泌型杀手树突细胞逐渐受到关注。干扰素分泌型杀手树突细胞可以从毒杀目标、抗原呈现到活化T细胞都由自己完成，还即干扰素分泌型杀手树突细胞找到目标后会毒杀目标，接着把碎片吞噬后呈现抗原给T细胞，并活化T细胞。然而，正如同前文述及，干扰素分泌型杀手树突细胞虽然在免疫反应中扮演了相当重要的角色，但因为干扰素分泌型杀手树突细胞在体内的量非常稀少，如此低的细胞比率及数目，需要繁琐的步骤来加以纯化，也限制了针对干扰素分泌型杀手树突细胞的进一步研究，不仅如此，目前的技术仅能从老鼠的脾脏、淋巴结或骨髓中分离出干扰素分泌型杀手树突细胞，使得要实际将其应用于研究或临床上皆面临了不小的瓶颈。
技术实现思路
有鉴于此，专利技术人经过长年的努力以及无数次的试验，成功筛选出了人类体内同时具有毒杀及抗原呈现功能的细胞，定义该细胞为树突状杀手细胞(Dendritic KillerCell，DKC)，又称为毒杀型树突细胞(cytoDC)或干扰素分泌型杀手树突细胞(IKDC)，更进一步，本专利技术不需要通过反复的手续从脾脏、淋巴结或骨髓中取得树突状杀手细胞，本专利技术技术可从人类外围血中鉴定并筛选出树突状杀手细胞。从专利技术人实验的结果严格说来，树突状杀手细胞在人类周边淋巴细胞中所占的比率低于0.01%,因此，能从人类外围血液样本中，鉴定及筛选出非常微量的树突状杀手细胞是相当困难的。故，本专利技术可从人类外围血中鉴定并筛选出树突状杀手细胞，不但检体取得方便且处理容易，对未来树突状杀手细胞的研究及一系列的免疫细胞疗法应用，具有非常显著的突破及贡献。因此，本专利技术提供一种，可以经由鉴定树突状杀手细胞的细胞表面标记，而从人类外围血中分选出树突状杀手细胞。后续将可针对这些分选出的树突状杀手细胞进行`更深入的研究(如:培养与实际疗效)，预期将可开启人类细胞免疫疗法的新契机。首先，本专利技术提供一种树突状杀手细胞的鉴定方法，涉及鉴定多个选自由HLA-G'自然杀手细胞表面标记及树突细胞表面标记所组成的群组的细胞表面标记。较佳地，该自然杀手细胞表面标记为⑶56+，更进一步，⑶56+为⑶56dim。较佳地，该树突细胞表面标记为HLA-DR+。更进一步，其中由该些细胞表面标记所组成的群组，包含不表现单核细胞表面标记、B细胞表面标记与T细胞表面标记的组成，其中不表现单核细胞表面标记、B细胞表面标记与T细胞表面标记的组成，分别为⑶14_、⑶19_与⑶3_。较佳地，上述鉴定方法可鉴定人类外围血检体中的树突状杀手细胞,更进一步,该人类外围血检体选自于一癌症病人的外围血。本专利技术的另一个目的在于，提供一种树突状杀手细胞的筛选方法，至少包含下列步骤。首先，提供一第一细胞群组，并检测第一细胞群组中⑶14与HLA-G的表现以分选出一第二细胞群组。接着，检测第二细胞群组中⑶19与⑶3的表现以分选出一第三细胞群组。最后，检测第三细胞群组中HLA-DR与⑶56的表现以得到一树突状杀手细胞群组。在本专利技术的一实施例中，其中第二细胞群组包含细胞表面标记为⑶14本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种树突状杀手细胞的鉴定方法，其特征在于，涉及鉴定多个选自由HLA?G?、表现自然杀手细胞表面标记及树突细胞表面标记所组成的群组的细胞表面标记。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：李建谋，
申请(专利权)人：富禾生医股份有限公司，
类型：发明
国别省市：