一种测定细胞DNA损伤标志物?H2AX含量的酶联免疫测定方法，其特征在于：是采用一种特异性H2AX抗体及酶标二抗对目标蛋白H2AX特异性夹心识别，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有荧光产物，可根据底物的荧光值实现对H2AX定量测定的方法。并利用该方法定量检测出由于卷烟烟气暴露而导致的细胞中H2AX的含量变化，从而达到评价卷烟烟气基因毒性的目的。与传统有机染料相比，酶标抗体具有以下优势：酶的催化频率高,能放大反应效果，提高检测灵敏度；酶在室温下性质稳定且价格便宜，适于大量分析。酶联免疫分析方法具有快速、准确、高通量、高灵敏等优点。?
【技术实现步骤摘要】
—种测定细胞DNA损伤标志物H2AX含量的酶联免疫测定方法
本专利技术涉及细胞DNA损伤标志物磷酸化组蛋白(H2AX)的酶联免疫检测技术，并将其用于卷烟烟气的基因毒性评估，具体是一种测定细胞DNA损伤标志物H2AX含量的酶联免疫测定方法。
技术介绍
DNA损伤有许多不同的形式，其中DNA双链断裂被认为是DNA最严重的损伤。当细胞发生DNA双链断裂后，组蛋白H2AX的丝氨酸残基可以被毛细血管共济失调突变基因(ATM)和DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)等磷酸化，形成 H2AX。 H2AX的形成与双链断裂数量成正比，从而使 H2AX成为DNA双链断裂的重要的特异性生物标志物。近年来，有大量文献开展了卷烟烟气导致DNA双链断裂的研究。Albino等使用 H2AX来评价卷烟烟气对人类A549肺癌细胞和正常的人支气管上皮细胞基因毒性，发现呈剂量效应关系，进一步研究表明H2AX与焦油含量正相关，而与卷烟类型和吸烟行为无关。Toyooka等研究证实卷烟主流和侧流烟气暴露于人类A549肺癌细胞，H2AX呈剂量效应关系且与时间正相关。目前H2AX的检测方法主要有免疫荧光法、流式细胞技术和高内涵细胞成像技术。这些技术所需仪器昂贵，都是利用 H2AX的特异性抗体和荧光分子标记的二抗实现对目标物定量测定的，所用的荧光分子均为传统有机染料。本实验所采用的二抗为酶标抗体，目前应用较多的有辣根过氧化物(HRP )、碱性磷酸酶(AP )等酶标记的抗体。
技术实现思路
本专利技术是基于现有技术状况而开发的细胞中DNA损伤标志物一 H2AX蛋白的酶联免疫检测方法，并利用该方法定量检测出由于卷烟烟气暴露而导致的细胞中 H2AX的含量变化，从而达到评价卷烟烟气基因毒性的目的。该检测方法具有快速、准确、高通量、高灵敏等特点。本专利技术的目的是通过以下具体步骤实现的:一种测定细胞DNA损伤标志物H2AX含量的酶联免疫测定方法，是采用一种特异性 H2AX抗体及酶标二抗对目标蛋白H2AX特异性夹心识别，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有荧光产物，可根据底物的荧光值实现对H2AX定量测定的方法，具体步骤如下: 1)实验试剂的配制，包括以下实验试剂:(I)细胞培养基，(2)4%多聚甲醛溶液，(3)PBS-T缓冲液，(4)细胞膜通透液，(5)封闭剂，(6)混合一抗溶液，(7)混合二抗溶液，(8)底物A，(9)底物B ; 2)细胞培养:人肺癌细胞A549细胞株培养于含10%胎牛血清的1640培养基中，于37°C,5% CO2培养箱中培养，细胞生长至汇合率为70%-80%时，用0.25%胰蛋白酶消化法进行细胞接种，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μ I生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μ I细胞悬液，最终细胞接种密度为5000个/孔，于37 °C、5% CO2条件下培养24 h ； 3)卷烟烟气粒相物萃取液及气相物吸收液的制备:卷烟样品于温度(22±1) °C和相对湿度60%±3%条件下平衡48 h ;然后使用转盘式吸烟机在ISO抽吸条件下抽吸卷烟，烟气总粒相物用剑桥滤片收集，根据烟气总粒相物质量加入相应体积的DMSO溶剂，得到最终浓度为10 mg/ml的烟气粒相物萃取液，使用前在一 70 °C以下储存；在收集烟气总粒相物的同时将气相物通入装有PBS溶液的吸收瓶中，粒相物收集完毕后，将PBS吸收液定容至与粒相物萃取液中DMSO体积相同，通过0.2 μπι的滤膜除菌后，得到最终浓度与粒相物萃取液相当的烟气气相物吸收液，且必须在制备后半小时内使用。4)卷烟烟气染毒:使用细胞培养基将烟气粒相物萃取液或烟气气相物吸收液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞培养24 h后，吸去培养液，分别设置7个不同浓度的烟气粒相物或烟气气相物染毒组和一个空白对照组，每组6个平行样孔，烟气粒相物染毒组每孔加入100 μ I不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液，烟气气相物染毒组每孔加入100 μ I不同浓度梯度的烟气气相物吸收液，空白对照每孔加入100 μ I稀释培养液，于37°C、5% C02条件下培养24 h ； 5)基于酶联免疫方法对细胞中 H2AX定量测定:(I)细胞固定:细胞染毒24 h后，小心移去培养基，用PBS溶液洗涤两次，每次至少5 min,以除去化合物染毒溶液，每孔加入100 μ I的4%多聚甲醛固定细胞15 min ；⑵固定好的A549细胞用PBS-T洗涤2次，每孔加入100 μ I通透液室温孵育15 min ； (3) PBS-T洗涤3次，滴加2% BSA封闭液37 °C湿盒中孵育I h ; (4)加入100 μ I含有兔抗总Η2ΑΧ抗体和小鼠抗 Η2ΑΧ抗体，在37 °C恒温培养箱中孵育2小时或4 °C过夜；(5) PBS-T洗涤3次，加入HRP标记驴抗鼠和AP标记的羊抗兔混合二抗溶液，在37 °〇恒温培育I小时；(6) PBS-T洗涤3次，向微孔板中加入75 μ I的辣根酶底物Α，孵育50 min,再加入75 μ I的碱性磷酸酶底物B，孵育30 min后经荧光酶标仪(540 nm处激发,在600 nm处检测和360 nm处激发,在450 nm处检测)测定突光强度值。6)数据处理:试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入酶标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号；本实验在检测目标物H2AX的同时，对细胞中总H2AX(不区分磷酸化标记)也进行了定量测定，根据目标物 H2AX与总H2AX荧光检测信号的比值来确定H2AX的磷酸化程度。在本专利技术中，步骤I)中各实验试剂的具体配制方法如下: (1）细胞培养基:溶剂为RPM1-1640培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM,青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100 μ g/ml ； (2)4%多聚甲醛溶液:40 g多聚甲醛、2.965 g磷酸二氢钠、29 g磷酸二氢钠和1000ml蒸馏水放入烧杯中，在磁力搅拌器上加热60 V振荡24 h ； (3)PBS-T缓冲液:0.2 g磷酸二氢钾，2.9 g磷酸氢二钠，8.0 g氯化钠，0.2 g氯化钾，0.5 ml吐温20，加水至1000 ml ； (4)细胞膜通透液:0.5% Triton X-100 的配制:取0.5 ml Triton X-100，加入至99.5ml的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中，混合后置37 °C~40 1:水使其充分溶解混匀； (5)封闭剂:2%牛血清白蛋白(BSA)溶液的配制:取2gBSAffi0.01 mol/1 PBS (pH7.4)溶解，定容至100 ml ； (6)混合一抗溶液:使用前取适量小鼠抗H2AX抗体和兔抗总H2AX抗体混合，用封闭剂稀释至所需浓度； (7)混合二抗溶液:使用前取适量HRP标记驴抗鼠和AP标记的羊抗兔混合二抗溶液混合，用封闭剂稀释至所需浓度； (8)底物A:取0.1M的Tris-HCl (PH=8.6)的缓冲液10 ml，加入0.0011 g鲁米诺，0.0008 g对碘苯酚为溶液Al ;取0.1 M的Tris -HCl (PH=8.6)的缓冲液10 ml，加入2.6ul30%的H2O2,本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定细胞DNA损伤标志物?H2AX含量的酶联免疫测定方法，其特征在于：是采用一种特异性?H2AX抗体及酶标二抗对目标蛋白?H2AX特异性夹心识别，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为荧光产物，可根据产物的荧光值实现对?H2AX定量测定的方法，具体步骤如下：1）实验试剂的配制，包括以下实验试剂：（1）细胞培养基，（2）4%多聚甲醛溶液，（3）PBS?T缓冲液，（4）细胞膜通透液，（5）封闭剂，（6）混合一抗溶液，（7）混合二抗溶液，（8）底物A，（9）底物B；2）细胞培养：人肺癌细胞A549细胞株培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，于37?℃，5％C02培养箱中培养,细胞生长至汇合率为70%?80%时，用0.25％胰蛋白酶消化法进行细胞接种,96?孔板的最外周36?个孔中每孔加入100?μl生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100?μl细胞悬液，最终细胞接种密度为5000?个/孔,于37?℃、5%?CO2?条件下培养24?h；3）卷烟烟气粒相物萃取液及气相物吸收液的制备：制备最终浓度为10?mg/ml的烟气粒相物萃取液，和与其浓度相当的烟气气相物吸收液；4）卷烟烟气染毒：使用细胞培养基将烟气粒相物萃取液或烟气气相物吸收液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞培养24?h?后，吸去培养液，分别设置7个不同浓度的烟气粒相物或烟气气相物染毒组和一个空白对照组，每组6个平行样孔，烟气粒相物染毒组每孔加入100?μl不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液，烟气气相物染毒组每孔加入100?μl不同浓度梯度的烟气气相物吸收液，空白对照每孔加入100?μl?稀释培养液，于37?℃、5%?CO2?条件下培养24?h；5）基于酶联免疫方法对细胞中?H2AX定量测定：(1)细胞固定：细胞染毒24?h后，小心移去培养基，用PBS溶液洗涤两次，每次至少5?min，以除去化合物染毒溶液，每孔加入100?μl的4%多聚甲醛固定细胞15?min；(2)固定好的A549细胞用PBS?T洗涤2次，每孔加入100?μl通透液室温孵育15?min；(3)PBS?T洗涤3次，滴加2%?BSA封闭液37?℃湿盒中孵育1?h；(4)?加入100?μl含有兔抗总H2AX抗体和小鼠抗?H2AX抗体，在37?℃恒温培养箱中孵育2小时或4?℃过夜；(5)PBS?T洗涤3次，加入HRP标记驴抗鼠和AP标记的羊抗兔混合二抗溶液，在37?℃恒温培育1小时；(6)PBS?T洗涤3次，向微孔板中加入75?μl的辣根酶底物A，孵育50?min，再加入75?μl的碱性磷酸酶底物B，孵育30?min后经荧光酶标仪（540?nm处激发，在600?nm处检测和360?nm处激发，在450?nm处检测）测定荧光强度值；6）数据处理：试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入酶标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号；本实验在检测目标物?H2AX的同时，对细胞中总H2AX（不区分磷酸化标记）也进行了定量测定，根据目标物?H2AX与总H2AX荧光检测信号的比值来确定H2AX的磷酸化程度。...
【技术特征摘要】
1.一种测定细胞DNA损伤标志物 H2AX含量的酶联免疫测定方法，其特征在于:是采用一种特异性 H2AX抗体及酶标二抗对目标蛋白H2AX特异性夹心识别，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为荧光产物，可根据产物的荧光值实现对H2AX定量测定的方法，具体步骤如下: O实验试剂的配制，包括以下实验试剂:(I)细胞培养基，(2) 4%多聚甲醛溶液，(3)PBS-T缓冲液，(4)细胞膜通透液，(5)封闭剂，(6)混合一抗溶液，(7)混合二抗溶液，(8)底物A，(9)底物B ; 2)细胞培养:人肺癌细胞A549细胞株培养于含10%胎牛血清的1640培养基中，于37°C,5% CO2培养箱中培养，细胞生长至汇合率为70%-80%时，用0.25%胰蛋白酶消化法进行细胞接种，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μ I生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μ I细胞悬液，最终细胞接种密度为5000个/孔，于37 °C、5% CO2条件下培养24 h ； 3)卷烟烟气粒相物萃取液及气相物吸收液的制备:制备最终浓度为10mg/ml的烟气粒相物萃取液，和与其浓度相当的烟气气相物吸收液； 4)卷烟烟气染毒:使用细胞培养基将烟气粒相物萃取液或烟气气相物吸收液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞培养24 h后，吸去培养液，分别设置7个不同浓度的烟气粒相物或烟气气相物染毒组和一个空白对照组，每组6个平行样孔，烟气粒相物染毒组每孔加入100 μ I不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液，烟气气相物染毒组每孔加入100 μ I不同浓度梯度的烟气气相物吸收液，空白对照每孔加入100 μ I稀释培养液，于37 °C、5%CO2条件下培养24 h ； 5)基于酶联免疫方法对细胞中H2AX定量测定:(I)细胞固定:细胞染毒24 h后，小心移去培养基，用PBS溶液洗涤两次，每次至少5 min，以除去化合物染毒溶液，每孔加入100 μ I的4%多聚甲醛固定细胞15 min ；⑵固定好的A549细胞用PBS-T洗涤2次，每孔加入100 μ I通透液室温孵育15 min ； (3) PBS-T洗涤3次，滴加2% BSA封闭液37 °C湿盒中孵育I h ; (4)加入100 μ I含有兔抗总Η2ΑΧ抗体和小鼠抗 Η2ΑΧ抗体，在37 °C恒温培养箱中孵育2小时或4 °C过夜；(5) PBS-T洗涤3次，加入HRP标记驴抗鼠和AP标记的羊抗兔混合二抗溶液，在37 °〇恒温培育I小时；(6) PBS-T洗涤3次，向微孔板中加入75 μ I的辣根酶底物Α，孵育50 min,再加入75 μ I的碱性磷酸酶底物B，孵育30 min后经荧光酶标仪(540 nm处激发,在600 nm处检测和360 nm处激发,在450 nm处检测)测定突光强度值； 6)数据处理:试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入酶标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号；本实验在检测目标物H2AX的同时，对细胞中总H2AX (不区分磷酸化标记)也进行了定量测定，根据目标物 H2AX与总H2AX荧光检测信号的比值来确定H2AX的磷酸化程度。2.根据权利要求1所述的测定细胞DNA损伤标志物H2AX含量的酶联免疫测定方法，其特征在于:步骤I)中各实验试剂的具体配制方法如下: (O细胞培养基:溶剂为RPM1-1640培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈欢，侯宏卫，付立伟，田永峰，韩书磊，刘彤，吴帅宾，胡清源，张小涛，石龙凯，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：
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