促造血的药物组合物及其应用制造技术

本发明专利技术的目的在于提供一种促造血的药物组合物及其应用，所述药物组合物中包含有细胞因子LIGHT；本发明专利技术首次成功的应用细胞因子LIGHT促进体内造血，提供了细胞因子LIGHT的新用途，可用于开发能够促进造血同时又能够抑制肿瘤细胞增殖的新型细胞因子和药物，对于促进临床肿瘤放化疗患者造血功能恢复，提高肿瘤治愈率，降低感染发生率，肿瘤复发率和死亡率具有重大意义，实现本发明专利技术的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种促造血的药物组合物及其应用，特别涉及一种促进以粒系为主的造血细胞增殖分化，同时又能够抑制肿瘤细胞生长的促造血的药物组合物及其应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子超家族包括将近19个成员，例如APRIL、BAFF、CD27L、CD30L、CD40L、LIGHT、TNF- a和TRAIL等等；肿瘤坏死因子受体超家族包括27个成员。肿瘤坏死因子超家族成员的生物学作用主要包括参与免疫系统的发育、功能调节和维持；参与炎症反应；参与造血调控及参与调节骨代谢。细胞因子LIGHT基因于1995年被鉴定为肿瘤坏死因子超家族成员。1998年，LIGHT CDNA被成功克隆并且LIGHT蛋白被确认为肿瘤坏死因子受体超家族成员TR2/HVEM 和LT-P R的配体。就其细胞学分布而言，LIGHT蛋白主要表达于激活的T细胞、不成熟树突状细胞、粒细胞、单核细胞、激活的NK细胞和血小板；HVEM主要表达于T细胞，B、NK、DC和髓系细胞也有HVEM表达；LT-PR广泛表达于肝细胞、胃肠道上皮细胞、淋巴组织基质细胞、单核细胞和树突状细胞，而成熟淋巴细胞缺乏LT- ^ R表达。就其组织学分布而言，LIGHT蛋白在脾脏高表达，在淋巴结、心脏、胎盘、肝脏、肺脏、阑尾和肾脏低表达；HVEM主要在肺脏、肝脏和肾脏表达，脑部有低表达。LT-PR在肺脏、肝脏和肾脏高表达，在淋巴结、心脏、脾脏和睾丸低表达。目前，细胞因子LIGHT已知的生物学功能主要在于免疫调控作用，如诱导树突状细胞成熟及T细胞激活过程中的辅助刺激等。此外，细胞因子LIGHT可诱导某些类型的肿瘤细胞凋亡以及B型慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡，并可通过增强免疫反应抑制肿瘤生长。细胞因子LIGHT亦是一种促炎因子，细胞因子LIGHT可诱导血管内皮细胞上表达粘附分子和趋化因子，并可促进血液中的单核细胞和树突状细胞迁移。当前细胞因子LIGHT的研究主要集中在外周血终末分化成熟细胞，因而对其功能的了解也主要局限于与外周血终末分化成熟细胞相关的免疫调节和炎症反应，而有关细胞因子LIGHT对干细胞的调控作用以及与之相关的生物学功能却知之甚少。最近发现细胞因子LIGHT能够促进胚胎干细胞分化，然而，细胞因子LIGHT对成体干细胞，尤其是对造血干细胞的生物学作用尚不清楚，从而限制了该因子在临床医学中的应用。肿瘤坏死因子(TNF- a )体外可以抑制造血干细胞向早幼红系祖细胞和粒系单核系祖细胞分化，体内可抑制晚期红系造血。TNF- a可以抑制多种生长因子刺激下的造血干、祖细胞的增殖，并抑制循环造血干细胞的稳定，毒副作用很大。从TNF-a和细胞因子LIGHT之间的关系分析，细胞因子LIGHT很可能也具有调控造血的作用。现有的实验认为，细胞因子LIGHT在体内体外均可以促进粒系为主的小鼠造血细胞的增殖和分化。目前肿瘤发病率日益增高，临床上主要采用放疗、化疗治疗恶性肿瘤，但其伴有的严重副作用，如骨髓抑制或损伤，会造成造血功能低下，白细胞减少和免疫力下降，从而限制了放化疗剂量的提闻和疗效；所以促进肿瘤患者造血功能恢复，对于提闻肿瘤治愈率，降低感染发生率，肿瘤复发率和死亡率非常关键。临床上主要应用重组人粒系集落刺激因子(rhG-CSF)和/或重组人粒单系集落刺激因子(rhGM-CSF)促进造血功能的恢复，但是rhG-CSF和rhGM-CSF也可以刺激残余的肿瘤细胞增殖，增加肿瘤的复发率。因此，特别需要能够促进造血同时又能够抑制肿瘤细胞增殖的新型细胞因子和药物，已解决上述现有存在的问题。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种促造血的药物组合物及其应用，促进以粒系为主的造血细胞增殖分化，而同时又能够抑制肿瘤细胞生长。本专利技术的第二个目的在于提供一种通过上述促造血的药物组合物中促造血细胞因子进行促进粒单系祖细胞生长的方法。本专利技术的第三个目的在于提供一种应用MOFLO XDP系统从骨髓单个核细胞中分离 造血干细胞、共同髓系祖细胞(CMP)和粒-单系祖细胞(GMP)的方法。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下本专利技术的第一方面，提供了一种促造血的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包含有细胞因子LIGHT。在本专利技术的一个实施例中，细胞因子LIGHT通过结合造血干、祖细胞表面的LIGHT受体HVEM和LT- ^ R，上调髓系转录因子PU. 1，促进GM-CSF和GM-CSFR表达。本专利技术的第二方面，提供了一种通过上述促造血的药物组合物中促造血细胞因子进行促进粒单系祖细胞生长的方法，其特征在于，进行体外促进粒单系祖细胞生长的方法包括如下步骤在适合粒单系祖细胞生长的甲基纤维素培养基中培养粒单系祖细胞，所述的培养基含有100ng/ml的细胞因子LIGHT。在本专利技术的一个实施例中，进行体外促进粒单系祖细胞生长的方法包括如下步骤注射包含细胞因子LIGHT的促造血的药物组合物。在本专利技术的一个实施例中，细胞因子LIGHT溶解于0. 1%的BSA溶液/盐水。本专利技术的第三方面，提供了一种应用MOFLO XDP系统从骨髓单个核细胞中分离造血干细胞、共同髓系祖细胞(CMP)和粒-单系祖细胞(GMP)的方法，其特征在于，它包括如下步骤步骤一、分离骨髓单个核细胞，并重悬于含2% FCS的PBS溶液中；步骤二、加入适量FCS，冰浴封闭15分钟；步骤三、取8只FALCON管，其中I只为同型对照染色管，6只为单染管，最后I只为分选细胞管，加入6种突光标记的抗体FITC_conjugated Lineageantibody Cocktail(BioLegend, San Diego, USA) ；PerCP/Cy5. 5-conjugated Sca-Iantibody (BioLegend, San Diego, USA) ；APC-conjugated c-kit antibody(BioLegend,San Diego, USA) ；PE/Cy7-conjugated IL-7Ra antibody(BioLegend, San Diego, USA)；V450-conjugated Fe y R lll/ll antibody(BD Horizon ) ；Alexa Fluor 700-conjugated0)34 antibody (eBioscience, San Diego, USA);同型对照染色管加入6种相对应的同型对照抗体，6只单染管分别加入其中一种荧光标记抗体和其余5种同型对照抗体，涡旋振荡器混匀，冰浴避光染色15分钟；步骤四、用含有2mM EDTA的2 % FCS/PBS溶液洗涤、离心、去上清，重悬于2% FCS/PBS 溶液中，上 Moflo XDP cell sorter 分选，设定 LirTSca-l+c-kit+细胞群为 HSC，IL-7Ra -LirTSca-rc-kit+CD34+Fc y Rlow 细胞群为 CMP，IL-7R a Xin-Sca-rc-kit+CD34+Fc y Rhi 细胞群为GMP。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果本专利技术首次成功的应用细胞因子LIGHT促进体内造血，提供了细胞因子LIGHT的新用途，可用于开发能够促进造血同时又能够抑制肿瘤细胞增殖的新型细胞因子和药本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ー种促造血的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包含有细胞因子LIGHT。2.根据权利要求I所述的促造血的药物组合物，其特征在于，细胞因子LIGHT通过结合造血干、祖细胞表面的LIGHT受体HVEM和LT-β R，上调髓系转录因子PU. I，促进GM-CSF和GM-CSFR表达。3.ー种通过权利要求I所述的促造血的药物组合物中促造血细胞因子进行促进粒单系祖细胞生长的方法，其特征在于，进行体外促进粒单系祖细胞生长的方法包括如下步骤在适合粒单系祖细胞生长的甲基纤维素培养基中培养粒单系祖细胞，所述的培养基含有100ng/ml的细胞因子LIGHT。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在干，进行体外促进粒单系祖细胞生长的方法包括如下步骤注射包含细胞因子LIGHT的促造血的药物组合物。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，细胞因子LIGHT溶解于O.I %的BSA溶液/盐水。6.一种应用MOFLO XDP系统从骨髓单个核细胞中分离造血干细胞、共同髓系祖细胞(CMP)和粒-单系祖细胞(GMP)的方法，其特征在于，它包括如下步骤 步骤一、分离骨髓单个核细胞，并重悬于含2% FCS的PBS溶液中； 步骤ニ、加入适量FCS，冰浴封闭15分钟； 步骤三、取8只FALCON管，其中I只为同型对照染色管，6只为单染管，最后I只为分选细胞管，加入6种突光标记的抗体FITC_conjugated Lineageantibody Co...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹刚明，陈维凯，刘长龙，姜少杰，丁华伟，王继峰，
申请(专利权)人：上海市肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：