本发明专利技术公开了一种内皮祖细胞的培养方法，采用人外周血单个核细胞接种于I型鼠尾胶原蛋白包被的细胞培养瓶中，在培养瓶内加入DMEM培养基并置于37℃,5%CO2,95%湿度的培养箱中培养；EPC的消化传代；然后进行EPC的细胞流式分析检测；EPC的免疫荧光检测；细胞增殖实验；单细胞成克隆实验；FITC-UEA-1胞外吸附、内吞Dil-acLDL实验检测；体外成管实验。本发明专利技术提供的EPC培养方法，简便可行，且可大大降低成本；本发明专利技术制备了高纯度的I型鼠尾胶原蛋白，将其包被细胞培养瓶用于EPC的培养，并采用了价格低廉的培养基，成功地从人外周血中培养出EPC，并通过鉴定证实其具有常规方法所培养出的EPC的表型特征和功能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物的细胞培养领域，特别涉及一种。
技术介绍
内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPC)是内皮细胞的一种前体细胞，具有增殖、迁移和分化为成熟内皮细胞的潜能，它在体内新生血管形成过程中发挥了重要的作用。Asahara等于1997年首次从成人外周血中分离培养出了 EPC,可在体外分化为内皮细胞，参与缺血组织的新生血管形成。之后的研究进一步证实，这类细胞是起源于骨髓的一种特殊细胞亚型。然而，在健康正常成人中，骨髓或外周血中EPC的含量较少，这使得EPC的分离培养较困难。通常对于EPC的分离培养，主要是将采集的骨髓或外周血通过密度梯度离心法获取单个核细胞，然后接种于特殊物质包被的培养瓶中进行体外诱导培养。目前，用于包被的特殊物质包括纤维连接蛋白、明胶、多聚赖氨酸等，它们能够与细胞表面某些整连蛋白识别与结合，介导细胞的粘附，促进细胞的迁徙、分化及骨架形成，有利于EPC在培养瓶中贴壁和生长。然而，这些用于包被的物质大多价格昂贵，且EPC培养过程中需要大量的生长因子诱导和特殊的内皮细胞培养基，从而大大地增加了 EPC的培养成本，限制其在临床和科研工作中的广泛应用(Asahara等，Science.1997; 275(5302): 964-7.Fadini等，CircRes.2012; 110 (4): 624-37.)。McCloskey等报道，采用鼠尾I型胶原蛋白包被培养瓶培养胚胎干细胞(ESC)，可以将胚胎干细胞诱导分化为高纯度的EPC，它具有内皮细胞的功能，具有成血管特性(McCloskey 等，Tissue Eng.2005; 11 (3-4):497-505)。国内也有研究者将鼠尾I型胶原蛋白包被培养瓶用于EPC的培养。王征宇等将小鼠ESC培养于鼠尾I型胶原蛋白包被的培养瓶中，可以迅速地形成内皮网络，表达内皮细胞的特征(王征宇等，中国医学科学院学报.2005; 27(1):62-6)。王红祥等将自制的鼠尾I型胶原蛋白包被法用于人外周血EPC的培养，并证实其是一种比常用的纤维连接蛋白更节省的培养方法(王红祥等，临床血液学杂志.2008; 21(3): 147-50)。由于自制鼠尾I型胶原蛋白操作简便，价格低廉，是一种较为理想的细胞培养瓶的包被物质。然而，对于自制的鼠尾I型胶原蛋白的纯度尚不清楚。同时，对于采用鼠尾I型胶原蛋白包被法所培养的EPC与常规培养法所培养EPC的功能有无差异尚未可知，鼠尾I型胶原蛋白包被法的有效性有待进一步证实。 因此，急需一种简便有效地培养内皮祖细胞的方法来克服上述的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，以解决现有技术中EPC的分离培养较困难和EPC的培养成本高昂的问题。 为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案:一种，包括以下步骤:步骤a.1型鼠尾胶原蛋白的制备与储存； 步骤b.1型鼠尾胶原蛋白包被细胞培养瓶；步骤c.人外周血单个核细胞的分离；步骤d.将上述分离的单个核细胞接种于I型鼠尾胶原蛋白包被的细胞培养瓶中，实验同时加入阴性对照组和阳性对照组，将三组培养瓶内均加入DMEM培养基在37°C，5%C02,95%湿度的培养箱中培养；步骤e.EPC的消化传代；步骤f.EPC的细胞流式分析检测；步骤g.EPC的免疫荧光检测；步骤h.细胞增殖实验,观察EPC的增殖能力；步骤1.单细胞成克隆实验，观察EPC的增殖和自我更新能力；步骤j.FITC-UEA-1胞外吸附、内吞Dil-acLDL实验检测EPC摄取FITC-UEA-UDil-acLDL 的能力；步骤k.体外成管实验，观察EPC在Matrigel上成血管样结构的能力，比较采用I型鼠尾胶原蛋白、纤维连接蛋白包被和未包被的方法培养的EPC的成管能力。 进一步的，所述步骤d中阴性对照组采用未包被的培养瓶，阳性对照组中采用纤维连接蛋白包被培养瓶。 进一步的，所述步骤d 中的 DMEM培养基含 10% FBSjVEGF 10ng/mL,bFGF 5ng/mL,TGF-β I 5ng/mL。 进一步的，所述步骤f中检测的抗体包括CD34-FITC、KDR-PE, CD133-FITC、CD31-PE、vffF-FITC, CD14-PE、CD45-FITC，统计分析三组中EPC表达特异性标记物的情况。 进一步的，所述步骤g中检测抗体:⑶34、1?1?、^133、^31、￥1?、^14、^45，在荧光显微镜下观察分析。 本专利技术的有益效果是:本专利技术提供的，简便可行，且大大降低了 EPC的培养成本；本专利技术制备了高纯度的I型鼠尾胶原蛋白，将其包被细胞培养瓶用于EPC的培养，并采用了价格低廉的培养基，成功地从人外周血中培养出EPC，并通过鉴定证实其具有常规方法所培养出的EPC的表型特征和功能；实验结果表明，采用本专利技术提供的培养方法可以成功地培养出EPC，未包被的培养瓶中EPC贴壁困难，生长缓慢，且成簇状生长，而包被I型鼠尾胶原蛋白的培养瓶中EPC贴壁容易，生长速度较快，且成片状生长；采用本专利技术提供的培养方法所培养的EPC可表达⑶34、KDR、⑶133XD31、vWF，但不表达⑶14和⑶45，经统计分析，⑶34、KDR、⑶133的表达率显著高于阴性对照组(p〈0.05)，与阳性对照组的表达率无明显差异(P>0.05);采用本专利技术提供的培养方法所培养的EPC的增殖潜能明显高于阴性对照组(P〈0.05)，与阳性对照组的增殖潜能无明显差异(p>0.05);采用本专利技术提供的培养方法所培养的EPC，在培养一周后，可由单个细胞增殖为一个超过14个细胞以上的克隆体；采用本专利技术提供的培养方法所培养的EPC，摄取FITC-UEA-1、Dil-acLDL的能力与阳性对照组相同；采用本专利技术提供的培养方法所培养的EPC的体外成管能力明显高于阴性对照组(P〈0.05)，与阳性对照组的表达率无明显差异(p>0.05)。 【附图说明】 图1:未用以及应用鼠尾I型胶原蛋白包被培养瓶7d时细胞贴壁情况。其中，A是未包被的培养瓶培养EPC的细胞贴壁情况图(X 100)；B是包被I型鼠尾胶原蛋白的培养瓶培养EPC的细胞贴壁情况图(X 100);图2 =EPC的流式分析统计结果；图3:三种培养方法培养EPC增殖曲线；图4:采用包被I型鼠尾胶原蛋白法所培养EPC的单细胞成克隆分析图；图5 =FITC-UEA-1胞外吸附、内吞Dil-acLDL实验鉴定EPC图(X200)，其中，A是FITC-UEA-1胞外吸附图，B是Dil-acLDL内吞图；图6 =EPC在Matrigel上的体外成管实验图。其中，A是阴性对照组未包被培养瓶培养EPC的体外成管实验图(X200)，B是包被I型鼠尾胶原蛋白的培养瓶培养EPC的体外成管实验图(X 200)，C是包被纤维连接蛋白的培养瓶培养EPC的体外成管实验图(X 200) ;D是三种方法培养的EPC成管统计分析图。 【具体实施方式】 为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本专利技术。 一种，包括以下步骤:步骤a.1型鼠尾胶原蛋白的制备与储存；步骤b.1型鼠尾胶原蛋白包本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤a. I型鼠尾胶原蛋白的制备与储存；步骤b. I型鼠尾胶原蛋白包被细胞培养瓶；步骤c.人外周血单个核细胞的分离；步骤d.将上述分离的单个核细胞接种于I型鼠尾胶原蛋白包被的细胞培养瓶中，实验同时加入阴性对照组和阳性对照组，将三组培养瓶内均加入DMEM培养基在37℃, 5%CO2, 95%湿度的培养箱中培养；步骤e. EPC的消化传代；步骤f. EPC的细胞流式分析检测；步骤g. EPC的免疫荧光检测；步骤h.细胞增殖实验，观察EPC的增殖能力；步骤i.单细胞成克隆实验，观察EPC的增殖和自我更新能力；步骤j. FITC‑UEA‑1胞外吸附、内吞Dil‑acLDL实验检测EPC摄取FITC‑UEA‑1、Dil‑acLDL的能力；步骤k.体外成管实验，观察EPC在Matrigel上成血管样结构的能力，比较采用I型鼠尾胶原蛋白、纤维连接蛋白包被和未包被的方法培养的EPC的成管能力。
【技术特征摘要】
1.一种内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤a.1型鼠尾胶原蛋白的制备与储存； 步骤b.1型鼠尾胶原蛋白包被细胞培养瓶； 步骤c.人外周血单个核细胞的分离； 步骤d.将上述分离的单个核细胞接种于I型鼠尾胶原蛋白包被的细胞培养瓶中，实验同时加入阴性对照组和阳性对照组，将三组培养瓶内均加入DMEM培养基在37°C，5%C02,95%湿度的培养箱中培养； 步骤e.EPC的消化传代； 步骤f.EPC的细胞流式分析检测； 步骤g.EPC的免疫荧光检测； 步骤h.细胞增殖实验,观察EPC的增殖能力； 步骤1.单细胞成克隆实验，观察EPC的增殖和自我更新能力； 步骤j.FITC-UEA-1胞外吸附、内吞Dil-acLDL实验检测EPC摄取FITC-UEA-UDil-acLDL 的能力； 步骤k.体外成管实验，观察EPC在Matrigel上成血管样结构的能力，比较采用I型鼠尾胶...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾瑞鹏，薛建新，周六化，葛余正，吴然，吴剑平，朱佳庚，曹朴，
申请(专利权)人：贾瑞鹏，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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