治疗肝损伤的干细胞制剂制造技术

本发明专利技术公开了一种治疗肝损伤的干细胞制剂，其中，所述治疗肝损伤的干细胞制剂包括：胚胎肝细胞、雌性激素、多糖以及溶剂，其中，所述胚胎肝细胞的浓度为(1～5)×105个/ml；所述雌性激素的浓度为20～50ng/ml；所述多糖的体积百分比为1～10％。本发明专利技术治疗肝损伤的干细胞制剂将胚胎肝细胞、雌性激素、多糖与溶剂共混而成，其中，该胚胎肝细胞作为一种肝干细胞，可以有效地修复受损的肝组织，同时分化增殖新的肝细胞，改善肝功能，从而治疗肝损伤；雌性激素促进胚胎肝细胞的自我更新能力，雌激素处理后的胚胎肝细胞分泌更多的血管内皮生长因子并增加血循环中的内皮祖细胞的数量，有利于改善肝纤维化时的肝血循环；多糖为细胞提供养分，保证细胞的活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞与组织工程
，尤其涉及一种治疗肝损伤的干细胞制剂。
技术介绍
肝纤维化及肝硬化是一种棘手的肝脏疾病。虽然肝移植是晚期肝硬化的有效治疗方法，但这些病人的预后仍很差；而且肝移植存在供体缺乏、手术损伤、免疫排斥及费用昂贵等问题。肝细胞移植被认为是器官移植的替代方法之一，不仅能临时维持等待肝移植的病人的肝功能，而且还能治疗某些肝脏代谢性疾病。但肝细胞是一种静止细胞，移植的肝细胞增殖数量少，难以达到临床治疗的效果，而且肝细胞难以培养和保存。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种治疗肝损伤的干细胞制剂，旨在提供肝干细胞而分化增殖肝细胞。为实现上述目的，本专利技术提供一种治疗肝损伤的干细胞制剂，所述干细胞制剂包括胚胎肝细胞、雌性激素、多糖以及溶剂，其中，所述胚胎肝细胞的浓度为(1～5)×105个/ml；所述雌性激素的浓度为20～50ng/ml；所述多糖的体积百分比为1～10％。优选地，所述胚胎肝细胞的浓度为2.5×105个/ml。优选地，所述雌性激素的浓度为35ng/ml。优选地，所述多糖的体积百分比为2％。优选地，所述胚胎肝细胞通过胰酶消化法从离体胚胎肝脏中分离获得。优选地，所述溶剂为水。本专利技术技术方案，通过将胚胎肝细胞、雌性激素、多糖与溶剂共混而成，其中，该胚胎肝细胞作为一种肝干细胞，可以有效地修复受损的肝组织，同时分化增殖新的肝细胞，改善肝功能，从而治疗肝损伤；雌性激素促进胚胎 肝细胞的自我更新能力，雌激素处理后的胚胎肝细胞分泌更多的血管内皮生长因子并增加血循环中的内皮祖细胞的数量，有利于改善肝纤维化时的肝血循环；多糖为细胞提供养分，保证细胞的活性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的内容获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1制备的人胚胎肝细胞在倒置相差显微镜下观察得到的形态示意图；图2为免疫细胞化学检测本专利技术实施例1制备的人胚胎肝细胞表达ALB及CK-19的示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供一种治疗肝损伤的干细胞制剂，该干细胞制剂包括原料如下：胚胎肝细胞、雌性激素、多糖以及溶剂。混合后，该干细胞制剂中，该胚胎肝细胞的浓度为(1～5)×105个/ml，该雌性激素的浓度为20～50ng/ml，该多糖的体积百分比为1～10％。换而言之，在1ml的干细胞制剂中，胚胎肝细胞有(1～5)×105个，雌性激素素A的用量为20～50ng，多糖的用量为0.01～0.1ml。本专利技术治疗肝损伤的干细胞制剂由胚胎肝细胞、雌性激素、多糖与溶剂共混而成，其中，该胚胎肝细胞作为一种肝干细胞，可以有效地修复受损的肝组织，同时分化增殖新的肝细胞，改善肝功能，从而治疗肝损伤(肝纤维化和肝硬化)；雌性激素促进胚胎肝细胞的自我更新能力，雌激素处理后的胚 胎肝细胞分泌更多的血管内皮生长因子并增加血循环中的内皮祖细胞的数量，有利于改善肝纤维化时的肝血循环；多糖为细胞提供养分，保证细胞的活性。需要说明的是，该胚胎肝细胞为肝干细胞的一种，作为肝细胞移植的细胞来源之一，其既表现出肝细胞的特性，又有很强的增殖活性。该多糖为细胞所需糖分，具体可以为肽聚糖、糖原、肝素、葡萄糖、甘露聚糖或者半乳聚糖。该溶剂只要满足提供胚胎肝细胞的存活的介质即可，具体可以是培养基、缓冲液或水等等，至于溶剂的用量可根据实际需求进行调配，均为本领域技术人员的常规做法，在此不做赘述。现通过实施例对本专利技术治疗肝损伤的干细胞制剂做进一步解释，以详细说明其技术方案及带来的技术效果。实施例1一、胚胎肝细胞的制备及检测1、组织来源选用临床上正常孕妇自然流产废弃的孕期为12～24周的胚胎肝脏组织(经伦理委员会批准)。2、胚胎肝细胞的原代培养与传代分离与原代培养：胚胎引出后于4℃保存运输至实验室，取出肝脏，去除外膜后、用D-Hank’s液(含双倍双抗)洗涤、至组织呈灰白色，剪碎后移至离心管中3000r/min离心7min，弃上清，加入含0.25％的胰酶/0.03％的EDTA消化液15mL于室温下消化8min，弃消化液，重新加入新鲜消化液15mL消化8min，将上清液移入新离心管中并用含血清的DMEM培养基终止消化，向原离心管中重新加入5～10mL消化液重复消化4次，将离心管中消化后的上清液3000r/min离心6min，弃上清，用含20％胎牛血清的DMEM培养基6mL重悬后移入培养瓶中，于37℃、5％CO2孵箱中培养。次日，弃上清，用D-Hank’s液冲洗后，补充新鲜培养基而调整细胞密度为2×106个/m1，于37℃、5％CO2孵箱中进行原代培养。传代：原代培养的第3天，细胞长至80％～90％汇合时，进行第一次传代；以后每4～5天传代一次；按常规1:3传代方法进行操作；进而制得胚胎肝细胞。3、胚胎肝细胞的检测形态学观察：在倒置相差显微镜下观察体外培养的人胚胎肝细胞的形态学特征，如图1所示。根据图1可知：人胚胎肝细胞体外原代培养第2天见细胞略呈团块样分布，细胞呈多边形，已有70％～80％汇合，如图1中A所示；体外连续传代，细胞维持多边形，并且排列较紧密，单个细胞体积较肝细胞型肝癌细胞系HepG-2大得多，随着代数的增加，细胞逐渐变长，但与成纤维细胞仍有较大区别，仍呈上皮细胞样，如图1中B、C所示；在传代肝细胞的前13代，细胞极易聚集成团(如图1中B所示)，以后逐渐消失；胚胎肝细胞在体外可连续传代至第30代(约5个半月)，此时细胞变大，呈煎蛋样摊开，形态不规则，细胞内颗粒增多，细胞老化不再增殖，如图1中D所示。免疫细胞化学：用Hepatozyme-SFM无血清培养基对人胚胎肝细胞进行培养，6孔培养板爬片培养7d时，用免疫细胞化学测定其中ALB及CK19的表达，操作按试剂盒说明书要求进行，人ALB及CK19抗体均以1:100稀释；其中，人胚胎肝细胞中的ALB及CK-19的表达如图2所示。根据图2可知：人胚胎肝细胞6孔培养板爬片培养5d时，免疫细胞化学测定ALB(如图2中A所示)及CK-19(如图2中B所示)在人胚胎肝细胞的细胞质中均有表达。因此，经检测，本实施例制备的人胚胎肝细胞具有肝干细胞的特征，同时具有肝细胞的特性。二、干细胞制剂的制备取步骤一制备的第3代人胚胎肝细胞5×106个，与雌性激素700ng、多糖0.4ml、适量的水共混，而制得20ml的干细胞制剂。进而，人胚胎肝细胞浓度为2.5×105个/ml，雌性激素的浓度为35ng/ml，多糖的体积百分比为2％。实施例2一、胚胎肝细胞的制备请参见实施例1，与实施例1相同。二、干细胞制剂的制备取步骤一制备的第3代人胚胎肝细胞2×106个，与雌性激素400ng、多 糖0.2ml、适量的水共混，而制得20ml的干细胞制剂。进而，人胚胎肝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗肝损伤的干细胞制剂，其特征在于，包括：胚胎肝细胞、雌性激素、多糖以及溶剂，其中，所述胚胎肝细胞的浓度为(1～5)×105个/ml；所述雌性激素的浓度为20～50ng/ml；所述多糖的体积百分比为1～10％。

【技术特征摘要】
1.一种治疗肝损伤的干细胞制剂，其特征在于，包括：胚胎肝细胞、雌性激素、多糖以及溶剂，其中，所述胚胎肝细胞的浓度为(1～5)×105个/ml；所述雌性激素的浓度为20～50ng/ml；所述多糖的体积百分比为1～10％。2.如权利要求1所述的治疗肝损伤的干细胞制剂，其特征在于，所述胚胎肝细胞的浓度为2.5×105个/ml。3.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，鲁菲，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44