一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用。本发明专利技术公开了一种干细胞外泌体制剂，包括：牙髓干细胞外泌体、牙髓干细胞、人血白蛋白和溶剂；所述牙髓干细胞外泌体为从牙髓干细胞提取的外泌体；每5mL所述制剂含有从1×106～1×107个所述牙髓干细胞提取的外泌体；所述牙髓干细胞的含量为5×106个/5mL；所述人血白蛋白的质量浓度为2～8％；所述溶剂为生理盐水。本发明专利技术还公开了所述外泌体制剂的制备方法和所述牙髓干细胞外泌体的制备方法。本发明专利技术还公开了所述的外泌体制剂或所述制备方法制得的外泌体制剂在制备治疗肾炎的生物制剂中的应用。本发明专利技术公开的干细胞外泌体制剂对肾炎具有良好的疗效。

Stem cell exocrine body preparation, preparation method and application thereof

The invention relates to the technical field of biotechnology, and discloses a preparation method and a preparation method thereof. The invention discloses a stem cell exosome preparations, including: dental pulp stem cell exosomes, dental pulp stem cells, Human Albumin and solvent; the dental pulp stem cell exosomes from exosome cells extracted from the stem of the pulp; each 5mL of the preparation containing from 1 * 106 to 1 * 107 the dental pulp stem cells extracted from the exosomes; the content of the dental pulp stem cells is 5 x 106 /5mL; the concentration of the Human Albumin is 2 ~ 8%; the solvent is saline. The invention also discloses a preparation method of the external secretion preparation and a preparation method of the dental pulp stem cell exocrine body. The present invention also discloses the application of the external secretion preparation or the preparation of the outer body of the preparation method in the preparation of biological preparation for treating nephritis. The invention discloses a stem cell exocrine body preparation which has good curative effect on nephritis.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用。
技术介绍
外泌体(exosomes)是一种由真核细胞的多泡内涵体(multivesicularbodies，MVBs)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的膜性小囊泡，可由多种类型细胞分泌，其内含有不同种类的蛋白质、脂质、mRNAs、microRNAs、信号分子等具有生物学活性的物质，较易与邻近细胞的细胞膜发生融合，将生物学活性物质选择性地递送至受体细胞，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞间的信号传导，发挥多种生物学功能。肾脏的生理功能主要是排泄代谢产物及调节水、电解质和酸碱平衡，分泌多种活性物质，维持机体内环境稳定，以保证机体的正常生理功能。肾炎是由免疫介导的、炎症介质(如补体、细胞因子、活性氧等)参与的，最后导致肾固有组织发生炎性改变，引起不同程度肾功能减退的一组肾脏疾病，可由多种病因引起。在慢性过程中也有非免疫、非炎症机制参与。治疗原则包括去除诱因，一般治疗，针对病因和发病机制的治疗，合并症及并发症的治疗和肾脏替代治疗。1.一般治疗：包括避免劳累，去除感染等诱因，避免接触肾毒性药物或毒物，采取健康的生活方式(如戒烟、适量运动和控制情绪等)以及合理的饮食。急性期应卧床休息，待临床症状好转后逐步增加活动量。急性期应给予低盐饮食(每日3g以下)。肾功能正常者不需要限制蛋白质入量，但氮质血症时应限制蛋白质摄入，并以优质动物蛋白为主。少尿者应限制液体入量。2.针对病因和发病机制的治疗：针对免疫发病机制的治疗，常包括糖皮质激素及免疫抑制剂治疗。血液净化治疗如血浆置换、免疫吸附等有效清除体内自身抗体和抗原-抗体复合物。针对非免疫发病机制的治疗，包括高血压、高血脂、高血糖、高尿酸血症、肥胖、蛋白尿及肾内高凝状态、肾素-血管紧张素系统激活、氧化应激等治疗。肾素-血管紧张素系统阻滞剂，如ACEI/ARB是延缓肾脏病进展最重要的治疗措施之一。3.合并症及并发症的治疗：肾脏病患者常存在多种合并症，如代谢异常、高血压、冠心病、心力衰竭和肝硬化等都可能加重肾脏病的进展，应积极治疗。对肾炎常用药物或手术治疗，治疗效果一般，对病人产生的创伤较大。且目前的治疗方法，只能对肾炎起到缓解作用，并不能从根本上根治疾病。因此，研发一种可用于治疗肾炎的外泌体制剂是本领域技术人员需要解决的技术问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术公开了一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用。本专利技术公开了一种外泌体制剂，包括：牙髓干细胞外泌体、牙髓干细胞、人血白蛋白和溶剂；所述牙髓干细胞外泌体为从牙髓干细胞提取的外泌体；每5mL所述制剂含有从1×106～1×107个所述牙髓干细胞提取的外泌体；所述牙髓干细胞的含量为5×106个/5mL；所述人血白蛋白的质量浓度为2～8％；所述溶剂为生理盐水。本专利技术还公开了上述外泌体制剂的制备方法，包括以下步骤：往溶剂中添加人血白蛋白，制成人血白蛋白质量浓度为2～8％的人血白蛋白溶液；然后往所述人血白蛋白溶液中添加所述牙髓干细胞外泌体，使每5mL所述制剂中含有从1×106～1×107个牙髓干细胞所提取的外泌体和5×106个牙髓干细胞，制得所述外泌体制剂。作为优选，所述牙髓干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：a)牙髓干细胞的原代培养：取健康人的智齿，清洗后剪碎牙齿，取出牙髓；将牙髓剪碎后进行消化，离心，弃上清后用培养基重悬后进行接种培养；5天后弃上清，补充新的培养基继续培养，待细胞形成较大的克隆，即可传代；b)牙髓干细胞的传代培养：取步骤a)得到的原代细胞，弃掉培养液，加入PBS缓冲液冲洗细胞生长面；弃去PBS缓冲液，用胰酶对细胞进行消化，并离心；弃上清，用培养基重悬细胞，对细胞进行传代培养；c)外泌体的分离：收集步骤b)传代培养的第2～5代牙髓干细胞培养上清，离心去除细胞碎片；取上清以2:1的比例加入外泌体分离试剂，混匀后4℃孵育过夜后离心，弃上清，用4℃预冷的PBS缓冲液重悬制得所述牙髓干细胞外泌体，置-20℃保存。作为优选，所述培养基为含10％FBS的DMEM培养基。作为优选，步骤a)所述消化为用I型胶原酶和中性蛋白酶分别消化30min。作为优选，步骤a)所述离心为1500rpm离心10min。作为优选，步骤c)所述的分离试剂购于invitrogen公司。本专利技术还公开了所述干细胞外泌体制剂或所述的制备方法制得的干细胞外泌体制剂在制备治疗肾炎的生物制剂中的应用。人血白蛋白可维持为制剂中的细胞提供营养，维持细胞的活性，保证制剂在回注后细胞的存活率。肾的被摸有三层，从内到外分为纤维囊、脂肪囊和肾筋膜。在治疗时，将所述外泌体制剂注射在脂肪囊处，避免直接注射进肾质内、对肾脏造成二次损伤。脂肪囊是包裹在肾脏外面的组织，其具有封闭腔隙，所述外泌体制剂注射进脂肪囊内的外泌体既能直接作用于肾脏，又可以避免血液流动而造成外泌体的损失。若进行肾血管输注，肾脏内的血流量大，制剂随血流而流失后所起作用甚微。外泌体可直接修复损失组织，增强未损伤组织的抵抗能力，大大地缩短组织修复的时间。外泌体不具有免疫原性，可适用任何个体。异基因细胞在输注后在体内的增殖、分化、寿命以及以此带来的免疫调节功能的变化的认识尚不很明确，临床应用所产生的问题陷入瓶颈期。外泌体的应用较异基因细胞的直接应用更为安全，可以开启非细胞治疗的方法。外泌体在提取后可长期保存，在应用时制剂制备更为方便，避免了细胞治疗方案需要重新培养细胞等操作。制剂中的牙髓干细胞可在制备所述牙髓干细胞外泌体的过程中同时制备，无需另外制备，制备过程方便。优选使用P2～P5代的牙髓干细胞作为外泌体制剂的组分。试验结果显示，本专利技术公开的干细胞外泌体制剂具有明显的治疗肾炎的功效。相比于现有技术，本专利技术具有以下优点：1、本专利技术公开的干细胞外泌体制剂对肾炎有良好的疗效；2、相比于异基因细胞的输注，外泌体制剂的使用更为安全；3、外泌体在提取后可长期保存，制剂制备更为方便，利于推广应用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为牙髓干细胞外泌体透射电镜图；图2为牙髓干细胞原代细胞显微镜图；图3为牙髓干细胞流式鉴定结果图。具体实施方式本专利技术公开了一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用，所述干细胞外泌体制剂对肾炎有良好的疗效。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术实施例中所使用到的组分或制剂均为市售或自制来源。本实施例所用组分及试剂均为自制或市售来源。外泌体分离试剂购自Invitrogen公司。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1制备牙髓干细胞外泌体牙髓干细胞的原代培养：取健康人的智齿，于超净台中进行无菌清洗，清洗后用钳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干细胞外泌体制剂，其特征在于，包括：牙髓干细胞外泌体、牙髓干细胞、人血白蛋白和溶剂；所述牙髓干细胞外泌体为从牙髓干细胞提取的外泌体；每5mL所述制剂含有从1×106～1×107个所述牙髓干细胞提取的外泌体；所述牙髓干细胞的含量为1×106～1×107个/5mL；所述人血白蛋白的质量浓度为2～8％；所述溶剂为生理盐水。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞外泌体制剂，其特征在于，包括：牙髓干细胞外泌体、牙髓干细胞、人血白蛋白和溶剂；所述牙髓干细胞外泌体为从牙髓干细胞提取的外泌体；每5mL所述制剂含有从1×106～1×107个所述牙髓干细胞提取的外泌体；所述牙髓干细胞的含量为1×106～1×107个/5mL；所述人血白蛋白的质量浓度为2～8％；所述溶剂为生理盐水。2.权利要求1所述外泌体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：往溶剂中添加人血白蛋白，制成人血白蛋白质量浓度为2％-8％的人血白蛋白溶液；然后往所述人血白蛋白溶液中添加所述牙髓干细胞外泌体及所述牙髓干细胞，使每5mL所述制剂中含有从1×106～1×107个牙髓干细胞所提取的外泌体和5×106个牙髓干细胞，制得所述外泌体制剂。3.权利要求1所述牙髓干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)牙髓干细胞的原代培养：取健康人的智齿，清洗后剪碎牙齿，取出牙髓；将牙髓剪碎后进行消化，离心，弃上清后用培养基重悬后进行接种培养；5天后弃上清，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，葛啸虎，王一飞，卢瑞珊，王小燕，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44