本发明专利技术公开了一种NK细胞体外培养方法，属于人类细胞的培养。本发明专利技术用PBS稀释的赫赛汀与用PBS稀释人免疫球蛋白，合并后均匀铺满培养瓶底，过夜；另取外周血行密度梯度离心，吸取单个核细胞，加入无血清培养基，调整细胞浓度为1.0×106/ml-3.0×106/ml；然后加入细胞因子IL-2、IL-15，加入到用赫赛汀包被的培养瓶中，孵箱培养。这样在保证了各个细胞亚群扩增倍数的基础上，促进NK细胞的生长和增殖，增强了淋巴细胞的杀伤活性，无血清培养基替代含血清的完全培养基，所得培养产物的数目和细胞活性相当，实现对NK细胞体外大规模培养，用于NK细胞的临床生物治疗，可以增加其临床应用的安全性。
【技术实现步骤摘要】
NK细胞体外培养方法
本专利技术涉及人类细胞的培养，具体是一种NK细胞体外培养方法。
技术介绍
自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)是机体重要的免疫细胞,是机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。在杀伤靶细胞的过程中，NK细胞可以非特异性识别祀细胞，并且不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)的限制，对多种肿瘤细胞有迅速杀伤和溶解作用。但是正常人体外周血中的NK细胞数量较少，仅占外周血淋巴细胞的10%~20%。因此，获得高质量高纯度的NK细胞成为其临床应用最为关键的问题之一。目前，随着生物治疗临床应用的广泛开展，NK细胞治疗取得了一定的临床疗效。据报道，多种细胞因子组合被广泛应用于NK细胞的体外培养。已知许多细胞因子如IL-2、IL-7、IL-15、IL-18等单独或组合均能有效地诱导、刺激特定的NK细胞增殖和促进其分化成熟，其中IL-2和IL-15的作用尤为明显。研究发现，骨髓⑶34+造血干/祖细胞并无抗人白血病K562细胞增殖的能力，只有经过IL-2等细胞因子诱导刺激培养后，⑶34+细胞定向分化为⑶3-⑶56+的NK细胞群才可抑制K562细胞增殖。IL-2具有激活NK细胞、促进NK细胞增殖分化和细胞因子的产生，通过细胞接触的方式来抑制K562细胞的增殖的特性。IL-15不仅可以上调NK细胞表面的活化性受体，如⑶16和NKG2D，产生大量的IFN- Y，还可以诱导骨髓⑶34+的淋巴细胞分化为NK细胞。IL-2和IL-15联合应用还可以诱导产生白细胞功能相关抗原_1 (lymphocytefunction-associated anti gen-1, LFA-1),参与效祀细胞结合。赫赛汀(Here印tin)是针对HER-2受体的人源化的单克隆抗体，可以与HER-2受体细胞外区域特异性结合，展现出显著的抗肿瘤效应，因而目前被广泛应用到HER-2过表达的乳腺癌患者的临床治疗。
技术实现思路
本专利技术就是为了解决现有技术中NK细胞体外大规模培养的问题，而提供一种NK细胞体外培养方法。本专利技术系采用单克隆抗体联合细胞因子的方法，在保证NK细胞体外扩增倍数、细胞比例的前提下，提高扩增产物的杀伤活性。本专利技术是按照以下技术方案实现的。一种NK细胞体外培养方法，该方法是按照以下步骤进行的: a.用PBS稀释Herceptin至浓度0.85-1.05mg/ml,取910 μ I ;用PBS稀释人免疫球蛋白至浓度l_2mg/ml，取400μ 1，合并后再用PBS补齐至20ml，均匀铺满培养瓶瓶底，密封置于4°C冰箱中过夜，次日取出，将液体倒出，用PBS洗2遍； b.取外周富集血4-10ml，用Ficoll法进行密度梯度离心，离心速度为350X g，离心时间为15-20分钟，吸取中间界面层的单个核细胞，用PBS洗涤3次，加入无血清培养基，调整细胞浓度为1.0 X 106/ml-3.0 X 106/ml ;然后加入细胞因子IL-2至终浓度10ng/ml，IL-15至终浓度50ng/ml，加入到已经用Herc印tin包被的培养瓶中，37°C，5% CO2孵箱中连续培养15天,每3天补加含20ng/ml的IL-2和100ng/ml的IL-15的无血清培养基一次,补液量与补液前液体量相同，即补液后体积为补液前的2倍。这样设计的本专利技术可以高效、安全的进行NK细胞体外大规模培养。由于加入Herceptin，在保证各个细胞亚群扩增倍数的基础上，又增强了淋巴细胞的杀伤活性；无血清培养基可替代含血清的完全培养基，二者所得培养产物的数目和细胞活性相当，而且无血清培养基用于NK细胞的临床生物治疗，可以增加其临床应用的安全性；细胞因子IL -2联合IL 一 15可以促进NK细胞的生长和增殖，可提高活化免疫细胞的杀伤活性。并分别从细胞扩增倍数、细胞表型以及细胞表面活化受体的表达等方面来检测扩增产物的杀瘤活性。【附图说明】图1是扩增产物的扩增倍数的对比图； 图2是扩增产物的细胞表型的对比图； 图3是扩增产物的杀伤活性对比图； 图4是扩增产物NK细胞表面活化受体表达对比图； 图5是扩增产物NKT细胞表面活化受体表达对比图； 图6是扩增产物T细胞表面活化受体表达对比图。【具体实施方式】下面结合附图及实施例对本专利技术进行详细的说明。一种NK细胞体外培养方法，该方法是按照以下步骤进行的: a.用PBS稀释Herceptin至浓度0.85-1.05mg/ml,取910 μ I ;用PBS稀释人免疫球蛋白至浓度l_2mg/ml，取400μ 1，合并后再用PBS补齐至20ml，均匀铺满培养瓶瓶底，密封置于4°C冰箱中过夜，次日取出，将液体倒出，用PBS洗2遍； b.取外周富集血4-10ml，用Ficoll法进行密度梯度离心，离心速度为350X g，离心时间为15-20分钟，吸取中间界面层的单个核细胞，用PBS洗涤3次，加入无血清培养基，调整细胞浓度为1.0 X 106/ml-3.0 X 106/ml ;然后加入细胞因子IL-2至终浓度10ng/ml，IL-15至终浓度50ng/ml，加入到已经用Herc印tin包被的培养瓶中，37°C，5% CO2孵箱中连续培养15天,每3天补加含20ng/ml的IL-2和100ng/ml的IL-15的无血清培养基一次,补液量与补液前液体量相同，即补液后体积为补液前的2倍。一、材料 赫赛汀(Herceptin, Trastuzumab)配方为:曲妥珠单抗440mg,稀释液为含1.1%苯甲醇的20ml灭菌注射用水,溶解后的曲妥珠单抗浓度为21mg/ml。购自Roche Pharma(瑞士)公司；静注人免疫球蛋白(Human Immunoglobulin for Intravenous Injection, 5%)配方为:人免疫球蛋白(Y球蛋白)含量不低于95%，其余主要为微量的白蛋白和痕迹量的IgA和IgM。购自中国成都蓉生药业有限责任公司； 磷酸盐缓冲液(PBS) pH=7.4的0.01mol/L，市售； 细胞因子IL-2和IL-15，购自美国PEPRO TECH公司； 培养瓶 175cm2，购自 CORNING INCORPORATED 公司； 无血清培养基，免疫细胞疗法研究用无血清培养液ALyS505N-0，日本细胞科学研究所株式会社。二、方法 1.用Herceptin和人免疫球蛋白包被板子 用PBS稀释Herc印tin (2lmg/ml)和人免疫球蛋白(5%)至浓度分别为0.95mg/ml和lmg/ml ,混匀后,用稀释好的Herceptin和人丙球蛋白进行包被板子,均匀的铺满瓶底,置于4 °C冰箱中过夜，次日取出，将液体倒出，用PBS洗2遍。2.外周血的制备 取外周血4-10ml，用Ficoll法进行密度梯度离心，离心速度为350 X g，15-20分钟，吸取中界面层的单个核细胞用PBS洗涤3次。加入无血清培养基，调整细胞浓度为2.0X IO6/ml，然后加入细胞因子IL-2至终浓度10ng/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种NK细胞体外培养方法，该方法是按照以下步骤进行的：a.用PBS稀释Herceptin至浓度0.85?1.05mg/ml，取910μl；用PBS稀释人免疫球蛋白至浓度1?2mg/ml，取400μl，合并后再用PBS补齐至20ml，均匀铺满培养瓶瓶底，密封置于4℃冰箱中过夜，次日取出，将液体倒出，用PBS洗2遍；b.取外周富集血4?10ml，用Ficoll法进行密度梯度离心,?离心速度为350×g，离心时间为15?20分钟，吸取中间界面层的单个核细胞，用PBS洗涤3次，加入无血清培养基，调整细胞浓度为1.0×106/ml?3.0×106/ml；然后加入细胞因子IL?2至终浓度10ng/ml，IL?15至终浓度50ng/ml，加入到已经用Herceptin包被的培养瓶中，37℃，5%?CO2孵箱中连续培养15天，每3天补加含20ng/ml的IL?2和100ng/ml的IL?15的无血清培养基一次，补液量与补液前液体量相同，即补液后体积为补液前的2倍。
【技术特征摘要】
1.一种NK细胞体外培养方法，该方法是按照以下步骤进行的: a.用PBS稀释Herceptin至浓度0.85-1.05mg/ml,取910 μ I ;用PBS稀释人免疫球蛋白至浓度l_2mg/ml，取400μ 1，合并后再用PBS补齐至20ml，均匀铺满培养瓶瓶底，密封置于4°C冰箱中过夜，次日取出，将液体倒出，用PBS洗2遍； b.取外周富集血4-10ml，用Ficoll法进行密度梯度离心，离心速度为350X g，离心时间为15-20分钟，吸取中间界面层的单个核细胞，用PBS洗涤3次，加入无血清培养基，调整细胞浓度为1.0 X 106/ml-3.0 X 106/ml ;然后加入细胞因子IL-2至终浓度10ng/ml，IL-15至终...
【专利技术属性】
技术研发人员：任秀宝，于津浦，
申请(专利权)人：天津医科大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：
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