环化循环置换荧光蛋白及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种环化循环置换荧光蛋白及其制备方法和用途，属于生物技术。本发明专利技术由融合基因编码表达，并迅速由蛋白内含子催化自发地环化而成，被相应的蛋白水解酶水解后产生荧光，因此可作为蛋白水解酶活性指示剂。这样设计的本发明专利技术，以环化循环置换荧光蛋白为蛋白水解酶的底物，以反应后产生的荧光为指标，不需要破坏样品，便可快速、准确地检测样品中的蛋白水解酶的活性，灵敏、直观、便捷、省时。不仅可以实现实时监测细胞内蛋白水解酶的活性，还可方便地检测体外蛋白水解酶的活性。由于荧光方法方便检测和操作，因此，本发明专利技术中的环化循环置换荧光蛋白及其表达基因能制备成检测水解蛋白酶活性的试剂，或试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术，具体是一种环化循环置换荧光蛋白及其制备方法和用途。
技术介绍
在20世纪60年代分离自维多利亚多管水母的绿色突光蛋白(Greenfluorescent protein, GFP )以及经改造获得的突变体构成的“GFP家族”蛋白得到飞速发展，逐步成为探索活体细胞合成代谢、分解代谢基本原理，了解各种酶的功能的重要手段，为深入研究及有效利用打下基础。荧光蛋白应用主要包括:(1)基因转录或作为一种与目的基因结合的报告基因。荧光蛋白基因在N端或C端与异源基因接合够成编码融合蛋白的嵌合基因，其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然荧光蛋白相似的荧光特性。荧光蛋白的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记，不仅可以用来在活体内追踪某一特定蛋白的合成、运输、和定位，还用于细胞器的动态观察、有丝分裂的研究、细胞骨架的成分分析和细胞分泌过程观察等，甚至也可以对某些DNA序列在活细胞的动态变化进行分析研究。与传统抗体标记技术相比具有更高的灵敏度，简化细胞固定、渗透压调整、抗体培养等操作步骤，可用荧光显微镜直接进行观察，而且荧光蛋白没有毒性，在不同的生物中都能高水平表达且不影响其生理机能。(2)双分子突光互补技术(Bimolecular fluorescencecomplementation, BiFC)。将突光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发突光的N端与C端2个多肽，称为N片段和C片段。这两个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发的组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。但当这两个荧光蛋白的片段分别连接到一组相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这两个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的两个片段在空间上相互靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，散发荧光。BiFC技术一经出现迅速得到广泛应用，已经成功用于多种蛋白质的相互作用，如大肠杆菌、酵母细胞、丝状真菌、哺乳动物细胞等。此技术的优点在于适用范围广泛，所研究的蛋白处于其天然的环境之中，能够直观的观察蛋白质的相互作用，并且与应用广泛研究体内蛋白质相互作用的酵母双杂交技术相比耗时比较短。(3)突光共振能量转换技术(FluorescenceResonance Energy Transfer,FRET)。当一个突光分子(如突光蛋白，作为供体)的发射谱与另一个荧光分子(作为受体)的吸收谱有重叠时，若这两个荧光分子距离靠近，则会通过供体和受体之间电磁偶极相互作用发生非辐射的能量转移。由于要发生能量转移要求供体和受体之间的距离小于10纳米，因此可用于研究分子的空间关系及相互作用。现已经发展了数十种不同吸收发射谱的荧光蛋白，已有许多实用的荧光蛋白组合，使得基于荧光蛋白的FRET成为应用最广泛的荧光技术之一。而且随着更多长波荧光蛋白的出现，发射谱在不断拓宽，又发展出了多色荧光共振转移技术进一步拓 展了该技术的应用。蛋白水解酶在体内广泛存在，在调节生物学功能方面起着非常重要的作用。凋亡是细胞自然发生的过程，是细胞的程序性死亡，并受基因调控，是有机体发育与功能不可缺少的一部分，包括两条主要途径:外源性死亡受体途径和内源性线粒体途径。其中一类蛋白水解酶Caspase起着至关重要的作用。当细胞外环境发生致死性改变时，外源性的凋亡途径被激活。存在于胞外的Fas> TNFa (Tumor Necrosis Factor)配体与其相应受体结合，凋亡信号由胞外结构域传递至胞内结构域，同时受体寡聚化，招募并结合辅因子FADD (Fas-Associated DeathDomain)、 TRADD (Tumor Necrosis Factor Receptor-1-Associated Death Domain),FADD、TRADD蛋白通过DED (Death Effector Domain,死亡效应域)与前体半胱氨酸蛋白酶Procaspase-8 (Cysteine Proteases)结合，此时形成 DISC (Death Inducing SignalingComplex,死亡诱导信号复合体)。结合的Procaspase-8通过自我剪切活化,一条途径是剪切BID蛋白(Bcl2 Interacting Protein, Bcl_2相互作用蛋白),其羧基端部分转位到线粒体，诱发CytoC (细胞色素C)的释放。释放的CytoC与APAFl (Apoptotic ProteaseActivating Factor-1,凋亡蛋白酶活化因子I)结合，同时结合dATP和Procaspase-9,并激活Caspase-9。活化的Caspase-9剪切Procaspase-3使其活化。另一条途径就是活化的Caspase-8直接剪切Procaspase-3使其活化。活化的Caspase-3剪切DNA裂解因子ICAD(Inhibitor of Caspase-Activated Dnase,依赖 Caspase-激活的 DNA 酶抑制因子)，此因子以异源二聚体形式存在，包含CAD与剪切ICAD两部分。剪切的ICAD与CAD分离，诱导具有DNA酶活性的CAD寡聚化。活化的CAD寡聚体进一步导致核小体间DNA的断裂，染色质浓集，细胞最终走向凋亡。 细胞凋亡也可以通过内源性途径诱导发生。细胞内源性应激损伤,如癌基因，DNA损伤，缺氧等均会导致线粒体膜通透性(Mitochondrial Membrane PermeabiIization)增力口。关于线粒体膜通透性的改变有两种机制:一种是VDAC (Voltage-Dependent AnionChannel,电压依赖性阴离子通道)，ANT (Adenine Nucleotide Transporter,腺嘌呤核苷酸转运因子)，PBR (Peripheral-type Benzodiazepine Receptor,外周型苯二氮卓受体)和 CypD (Cyclophilin-D,亲环蛋白 D)共同形成 PTPC (Permeability Transition PoreComplex,通透性转换孔复合体)。此复合体可能与BAX(Bcl2 Associated X-protein,Bcl2相关蛋白X)，BAKl (Bcl2 Antagonist Killer-1, Bcl2蛋白拮抗剂-1)加速线粒体膜孔道开放有关。另外一种是BAX释放并从细胞质转位到线粒体中，在凋亡信号作用下寡聚化形成蛋白孔道。线粒体膜通透性增加导致CytoC释放增多，最终导致Caspase-9的激活。活化的Caspase-9随后剪切Caspase-3，引起下游通路中的一系列变化，导致细胞凋亡。由此可见，Caspases是细胞凋亡通路下游的关键蛋白水解酶，对其活性的监测能够反映出细胞的生存状态及细胞内外生理病理变化。
技术实现思路
本专利技术就是在已有荧光蛋白的基础上，提供一种检测蛋白水解酶的活性的环化循环置换荧光蛋白及其制备方法和用途。本专利技术是按照以下技术方案实现的。一种环化循环置换荧光蛋白，所述蛋白是环状蛋白，由编码融合循环置换荧光蛋白的基因表达，并迅速由其中的蛋白内含子催化自发环化而成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环化循环置换荧光蛋白，其特征在于：所述蛋白是环状蛋白，由编码融合循环置换荧光蛋白的基因表达，并迅速由其中的蛋白内含子催化自发环化而成，以荧光蛋白mVenus为模板的融合基因编码表达的VPAI，含蛋白水解酶的识别位点DEVDG，经蛋白水解酶Caspase?3水解后产生黄色荧光，成为蛋白水解酶活性指示剂，VPAI的氨基酸序列如序列表中VPAI序列所示。

【技术特征摘要】
1.一种环化循环置换荧光蛋白，其特征在于:所述蛋白是环状蛋白，由编码融合循环置换荧光蛋白的基因表达，并迅速由其中的蛋白内含子催化自发环化而成，以荧光蛋白mVenus为模板的融合基因编码表达的VPAI，含蛋白水解酶的识别位点DEVDG，经蛋白水解酶Caspase-3水解后产生黄色荧光，成为蛋白水解酶活性指示剂，VPAI的氨基酸序列如序列表中VPAI序列所示。2.根据权利要求1所述的环化循环置换荧光蛋白，其特征在于:以荧光蛋白Cerulean为模板的融合基因编码表达的CPAI，含蛋白水解酶的识别位点DEVDG，经蛋白水解酶Caspase-3水解后产生青色荧光，成为蛋白水解酶活性指示剂，CPAI的氨基酸序列如序列表中CPAI序列所示。3.根据权利要求1所述的环化循环置换荧光蛋白，其特征在于:以荧光蛋白SfGFP为模板的融合基因编码表达的GPAI，含蛋白水解酶的识别位点DEVDG，经蛋白水解酶Caspase-3水解后产生绿色荧光，成为蛋白水解酶活性指示剂，GPAI的氨基酸序列如序列表中GPAI序列所示。4.根据权利要求1所述的环化循环置换荧光蛋白，其特征在于:以荧光蛋白mCherry为模板的融合基因编码表达的mCPAI，含蛋白水解酶的识别位点DEVDG，经蛋白水解酶Caspase-3水解后产生绿色荧光，成为蛋白水解酶活性指示剂，mCPAI的氨基酸序列如序列表中mCPAI序列所示。5.根据权利要求1所述环化循环置换荧光蛋白的制备方法，其特征在于: ①环化循环置换荧光蛋白基因表达质粒的构建， a.将线状荧光蛋白游离的N端与C端缩短，保留荧光蛋白功能的序列， ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兵辉，张矫，
申请(专利权)人：天津医科大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：