环化循环置换荧光蛋白及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种环化循环置换荧光蛋白及其制备方法和用途，属于生物技术。本发明专利技术由融合基因编码表达，并迅速由蛋白内含子催化自发地环化而成，被相应的蛋白水解酶水解后产生荧光，因此可作为蛋白水解酶活性指示剂。这样设计的本发明专利技术，以环化循环置换荧光蛋白为蛋白水解酶的底物，以反应后产生的荧光为指标，不需要破坏样品，便可快速、准确地检测样品中的蛋白水解酶的活性，灵敏、直观、便捷、省时。不仅可以实现实时监测细胞内蛋白水解酶的活性，还可方便地检测体外蛋白水解酶的活性。由于荧光方法方便检测和操作，因此，本发明专利技术中的环化循环置换荧光蛋白及其表达基因能制备成检测水解蛋白酶活性的试剂，或试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术，具体是一种环化循环置换荧光蛋白及其制备方法和用途。
技术介绍
在20世纪60年代分离自维多利亚多管水母的绿色突光蛋白(Greenfluorescent protein, GFP )以及经改造获得的突变体构成的“GFP家族”蛋白得到飞速发展，逐步成为探索活体细胞合成代谢、分解代谢基本原理，了解各种酶的功能的重要手段，为深入研究及有效利用打下基础。荧光蛋白应用主要包括:(1)基因转录或作为一种与目的基因结合的报告基因。荧光蛋白基因在N端或C端与异源基因接合够成编码融合蛋白的嵌合基因，其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然荧光蛋白相似的荧光特性。荧光蛋白的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记，不仅可以用来在活体内追踪某一特定蛋白的合成、运输、和定位，还用于细胞器的动态观察、有丝分裂的研究、细胞骨架的成分分析和细胞分泌过程观察等，甚至也可以对某些DNA序列在活细胞的动态变化进行分析研究。与传统抗体标记技术相比具有更高的灵敏度，简化细胞固定、渗透压调整、抗体培养等操作步骤，可用荧光显微镜直接进行观察，而且荧光蛋白没有毒性，在不同的生物中都能高水平表达且不影本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环化循环置换荧光蛋白，其特征在于：所述蛋白是环状蛋白，由编码融合循环置换荧光蛋白的基因表达，并迅速由其中的蛋白内含子催化自发环化而成，以荧光蛋白mVenus为模板的融合基因编码表达的VPAI，含蛋白水解酶的识别位点DEVDG，经蛋白水解酶Caspase?3水解后产生黄色荧光，成为蛋白水解酶活性指示剂，VPAI的氨基酸序列如序列表中VPAI序列所示。

【技术特征摘要】
1.一种环化循环置换荧光蛋白，其特征在于:所述蛋白是环状蛋白，由编码融合循环置换荧光蛋白的基因表达，并迅速由其中的蛋白内含子催化自发环化而成，以荧光蛋白mVenus为模板的融合基因编码表达的VPAI，含蛋白水解酶的识别位点DEVDG，经蛋白水解酶Caspase-3水解后产生黄色荧光，成为蛋白水解酶活性指示剂，VPAI的氨基酸序列如序列表中VPAI序列所示。2.根据权利要求1所述的环化循环置换荧光蛋白，其特征在于:以荧光蛋白Cerulean为模板的融合基因编码表达的CPAI，含蛋白水解酶的识别位点DEVDG，经蛋白水解酶Caspase-3水解后产生青色荧光，成为蛋白水解酶活性指示剂，CPAI的氨基酸序列如序列表中CPAI序列所示。3.根据权利要求1所述的环化循环置换荧光蛋白，其特征在于:以荧光蛋白SfGFP为模板的融合基因编码表达的GPAI，含蛋白水解酶的识别位点DEVDG，经蛋白水解酶Caspase-3水解后产生绿色荧光，成为蛋白水解酶活性指示剂，GPAI的氨基酸序列如序列表中GPAI序列所示。4.根据权利要求1所述的环化循环置换荧光蛋白，其特征在于:以荧光蛋白mCherry为模板的融合基因编码表达的mCPAI，含蛋白水解酶的识别位点DEVDG，经蛋白水解酶Caspase-3水解后产生绿色荧光，成为蛋白水解酶活性指示剂，mCPAI的氨基酸序列如序列表中mCPAI序列所示。5.根据权利要求1所述环化循环置换荧光蛋白的制备方法，其特征在于: ①环化循环置换荧光蛋白基因表达质粒的构建， a.将线状荧光蛋白游离的N端与C端缩短，保留荧光蛋白功能的序列， ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兵辉，张矫，
申请(专利权)人：天津医科大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：