一种巨噬细胞移动抑制因子及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是一种巨噬细胞移动抑制因子MIF及其制备和应用。巨噬细胞移动抑制因子为序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。制备方法：以美国红鱼cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物连接表达载体后得质粒pMIF1，将其转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过亲和层析纯化获得重组巨噬细胞移动抑制因子MIF。本发明专利技术的巨噬细胞移动抑制因子能够显著抑制细菌感染鱼类。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是一种巨噬细胞移动抑制因子MIF及其制备和应用。
技术介绍
巨卩遼细胞移动抑制因子(Macrophagemigration inhibitory factor)是一个约12.5kDa的蛋白，主要由激活的淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等分泌。巨噬细胞移动抑制因子具有多种功能，包括抑制巨曬细胞定向迁移、调控糖皮质激素(glucocorticoid)介导的免疫抑制效应等，但其主要功能是参与炎症反应。在哺乳动物中，巨噬细胞移动抑制因子储存于细胞质中，在外源刺激时(例如病原侵染)，细胞质中的巨噬细胞移动抑制因子迅速释放质胞外。释放的巨噬细胞移动抑制因子作为细胞因子而调控急性和慢性炎症反应，从而影响机体的免疫应答。因此，巨噬细胞移动抑制因子在机体抗细菌、病毒感染反应过程中起重要作用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种巨噬细胞移动抑制因子MIF及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为:一种巨噬细胞移动抑制因子(MIF)，巨噬细胞移动抑制因子MIF为序列表SEQ IDN0.1中的氨基酸序列所示。巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的制备方法:I)质粒pMIF的构 建:以美国红鱼cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与SwaI酶切的质粒PET259用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pMIF ；所述Fl 为 5’ -GATATCATGCCGATGTTTGTGGTG-3’，Rl 为 5’ -GATATCGCCAAAGGTAGTGTTGTTCC-3’ ；2)将上述所得质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，通过亲和层析纯化获得序列表SEQID N0.1所示的巨噬细胞移动抑制因子MI F。巨噬细胞移动抑制因子MIF的应用:所述巨噬细胞移动抑制因子MIF用于制备抗细菌药物或抗细菌抑制剂。本专利技术具有如下优点:本专利技术的巨噬细胞移动抑制因子能够显著抑制细菌侵染。附图说明图1为本专利技术实施例提供的经纯化的蛋白电泳检测图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法:1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.大肠杆菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning: ALaboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)。3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。实施例1本专利技术的巨噬细胞移动抑制因子MIF为序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列。序列表SEQ ID N0.1 为:MPMFWNTNVAKCDVPAGLLSEATEELAKAMGKPAQYIAVHINPDQMMMFGGKGDPCALCSLHSIGKISGAHNKQYSKLPCGLLNKHLGISADRIYINFVDMDAANVAWNNTTFG(a)序列特征: 长度:115 类型:氨基酸序列籲链型:单链 拓扑结构:线性(b)分子类型:蛋白质(C)假设:否(d)反义:否 (e)最初来源:美国红鱼结构特点:该蛋白预期含有一个互变异构酶(tautomerase )结构域(氨基酸10-56)。实施例2重组MIF的制备:I)质粒pMIF的构建:以美国红鱼cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为:94°C 60s预变性模板 DNA，然后 94°C 40s, 57°C 60s, 72°C 60s，5 个循环后改为 94°C 40s, 62°C60s, 72°C 608，30个循环后再在721:延伸反应7-101^11。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。将载体 pET259 (pET259 构建过程参见 Zheng, ff.J.，Hu, Y.H.，Sun, L.，2010.Cloning and analysis of a ferritin subunit from turbot (Scophthalmus maximus).Fish.Shellfish.1mmunol.28，829-836)用SwaI酶切后回收5.4kb片段，将其与上述纯化的PCR片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，在含卡那霉素(30ug/ml)的LB固 体培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pMIF。所述LB固体培养基组成成分按重量百分比计:1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，1.2%琼脂，96.3%蒸馏水。所述 Fl 为 5，-GATATCATGCCGATGTTTGTGGTG-3’ ；R1 为5’ -GATATCGCCAAAGGTAGTGTTGTTCC-3’。2 )重组MIF的表达纯化将上述的质粒pMIF用常规方法转化大肠杆菌BL21 (DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(30ug/ml)的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取一个转化子，将其命名为BL21/pMIF。将BL21/pMIF于含有卡那霉素(30ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取Iml过夜后的培养液，加入IOOml新鲜的含有卡那霉素(30ug/ml)的LB液体培养基中，于37°C下转速200rpm摇动培养至0D_为0.6，加入终浓度为0.3mM的IPTG，30°C继续以转速160rpm摇动培养5_6h，而后以5000g，4°C离心lOmin，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以lOOOOg，4 离心30min,回收上清液。将上清液采用蛋白亲和层析柱His Trap HP Columns (购于美国GE Healthcare公司)回收纯化,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25-30min，随后15v/cm电压下电泳2_2.5h)，发现其分子量与MIF相同，即为重组MIF (参见图1)。所述裂解液为终浓度的IOmM NaH2PO4, IOmM Tris和8M尿素，pH 8.0。所述LB液体培养基组成成分按重量百分比计:1.0 %蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0 %氯化钠，97.5%蒸馏水。实施例3重组MIF的应用步骤I)蛋白注射将上述实施例2步骤2)的重组MIF在PBS中稀释至0.8mg/ml,即为MIF稀释液。将10条美国红鱼(重约560g)随机分为2组，每组5条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼腹腔注射IOOul MIF稀释液，将B组(对照组)的每条鱼腹腔注射IOOul PBS0所述PBS组成成分按重量百分比计:0.8 % NaCl, 0.02 % KCl, 0.358 %Na2HPO4.12H20, 0.024 % NaH2PO4,余量为水。步骤2)细菌悬液制备在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TXl至OD6tltl为0.8，然后离心(5000g，4°C，lOmin)，收集菌体，将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种巨噬细胞移动抑制因子（MIF），其特征在于：巨噬细胞移动抑制因子MIF为序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。

【技术特征摘要】
1.一种巨噬细胞移动抑制因子(MIF)，其特征在于:巨噬细胞移动抑制因子MIF为序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示。2.一种权利要求1所述的巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的制备方法，其特征在于: 1)质粒PMIF的构建: 以美国红鱼cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与SwaI酶切的质粒PET259用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒 pMIF ...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，邱礽，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：