本发明专利技术提供一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法，应用IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼体外诱导Vγ9Vδ2T细胞的生成，得到了诱导效率更高及活性更高的Vγ9Vδ2T细胞本发明专利技术方法诱导培养过程简单易行，周期短，成本低廉；诱导效率高，重复性好；诱导后得到的细胞活性增强，诱导培养后细胞数量和功能有望提高目前Vγ9Vδ2T细胞免疫治疗肿瘤的疗效，具有很好的应用潜能。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供，应用IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼体外诱导Vγ9Vδ2T细胞的生成，得到了诱导效率更高及活性更高的Vγ9Vδ2T细胞本专利技术方法诱导培养过程简单易行，周期短，成本低廉；诱导效率高，重复性好；诱导后得到的细胞活性增强，诱导培养后细胞数量和功能有望提高目前Vγ9Vδ2T细胞免疫治疗肿瘤的疗效，具有很好的应用潜能。【专利说明】—种提高V Y 9V S 2T细胞扩增效率及活性的培养方法
本专利技术属于免疫学与与细胞生物学研究领域，涉及一种提高细胞扩增效率及活性的体外诱导培养方法，是应用细胞因子联合酪氨酸激酶抑制剂协同诱导V Y 9V S 2T细胞生成的培养方法。
技术介绍
y 6 T细胞是近年来倍受关注的具有独特的结构和生物学功能的T淋巴细胞亚群，虽然在外周血和淋巴器官中所占比例很小(1_5%)，但其在机体抗感染和抗肿瘤等方面起着举足轻重的作用。VY9VS2T细胞是Y S T细胞的重要亚群，占外周Y S T细胞的5(T70%。自从Kunzmann等首次发现Vy 9V S 2T细胞能够大量扩增后，越多越多的学者开始致力于该类细胞群体的研究。已在体外实验和体内动物实验中已证实V Y 9V S 2T细胞具有广泛的肿瘤杀伤潜能；与传统的a P T细胞不同，其杀伤肿瘤作用不受MHC限制，极大的拓宽了其应用。目前Vy 9V S 2T细胞免疫治疗已在多项实体瘤及血液系统恶性肿瘤等I期和II期临床研究中初具疗效，安全性好，使很多患者从中受益。细胞免疫抗肿瘤治疗需要有充足的细胞来源,虽然通过目前的方法，通过人工合成的磷酸化合物或氨基二碳磷酸盐化合物(Aminobisphosphonates, NBPs)类药物可在体外或体内对V Y 9V S 2T细胞进行大量扩增。但为保证V Y 9V S 2T细胞治疗理想的效靶比，仍有必要对目前的诱导方案进行优化。此外，目前诱导所得Vy 9V S 2T细胞的杀伤肿瘤效率不尽如人意，制约了 V Y 9V S 2T细胞免疫治疗疗效。通过联合药物提高目前V Y 9V S 2T细胞的体外诱导扩增效率及活性是Vy 9V S 2T细胞免疫治疗研究的热点。如能克服目前面临的主要障碍，将使V Y 9V S 2 T细胞肿瘤免疫治疗从真正意义上取得成功。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有方案中V Y 9V S 2T细胞诱导扩增效率及活性有限的缺点，提供一种提高细胞扩增效率及活性的培养方法，为进一步提高V Y 9V S 2T细胞为基础的抗肿瘤免疫治疗疗效提供支持。本专利技术通过以下步骤实现: 1、人单个核细胞制备:取外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞，用含10%胎牛血清完全RPMI 1640培养液重悬细胞； 2>Vy9V62T细胞诱导:步骤I中所制备的单个核细胞接种当日按第0天计算，在第0天加入唑睞膦酸2.24umol/L及IL-2 250 IU/ml刺激V y 9V 6 2T细胞扩增，在第I天加入达沙替尼lOnmol/L，接着于第3、6、9、12、15、18天进行半量换液，每次换液时加入新鲜IL-2及达沙替尼，浓度同前； 3、Vy9VS 2T细胞扩增效率检测:于第9、12、15、18天时检测Vy 9V S 2T细胞的扩增效率(包括纯度及绝对数量检测):收集步骤2中的细胞，采用流式细胞术检测V Y 9V S 2T细胞的纯度，以TCRV S 2阳性作为VY 9V S 2T细胞的表型特征，计算Vy 9V S 2T细胞占外周血单个核细胞的百分含量；采用细胞计数仪检测活细胞密度，并根据以下公式计算V Y 9V S 2T细胞的绝对数量: Vy 9V 6 2T细胞绝对数量=V Y 9V S 2T细胞纯度X活细胞密度X总体积； 4、诱导的VY 9V S 2T细胞表面活化分子及死亡受体检测:于第18天收集步骤2中的细胞，采用流式细胞术检测V Y 9V S 2T细胞表面活化分子⑶69、HLA-DR及死亡受体Fas分子表达的比例，以TCRV 6 2阳性作为V Y 9V S 2T细胞的表型特征，计算公式为:Vy 9V 8 2T 细胞 CD69/HLA-DR/ Fas 表达(％)= CD69/HLA_DR/Fas 和 TCRV 8 2 双阳性细胞/ TCRV 8 2单阳性细胞X 100 ； 5、诱导的Vy9V S 2T细胞效应型亚群比例检测:于第18天收集步骤2中的细胞，采用流式细胞术检测V Y 9V S 2T细胞的功能亚型分布，以TCRV 6 2阳性作为V Y 9V S 2T细胞的表型特征，以CD27分子为区分效应型亚群的表型特征，计算公式为: Vy 9V 8 2T细胞效应型亚群比例(%)= CD27阴性TCRV 8 2阳性细胞/ TCRV 8 2单阳性细胞XlOO ； 6、诱导的Vy9V S 2T细胞对肿瘤细胞的的穿孔素、颗粒酶释放效应检测:于第18天收集步骤2中的细胞，采用流式细胞术检测V Y 9V S 2T细胞与急性髓系白血病(AML)细胞株K562共同孵育4个小时后检测V Y 9V S 2T细胞对AML细胞刺激的穿孔素、颗粒酶释放效应，以TCRV 6 2阳性作为V Y 9V S 2T细胞的表型特征，以⑶107a分子阳性作为穿孔素、颗粒酶释放效应的检测标记，计算公式为: VY 9V S 2T细胞穿孔素、颗粒酶释放效应(％)=⑶107a和TCRV S 2双阳性细胞/TCRV 8 2单阳性细胞X 100 ； 7、诱导的Vy9V S 2T细胞IFN-Y细胞因子分泌能力检测:于第18天收集步骤2中的细胞，采用流式细胞术检测V Y 9V S` 2T细胞在PMA/离子霉素刺激4个小时后检测V Y 9V S 2T细胞干扰素-Y (IFN- y )细胞因子的分泌能力，以TCRV 6 2阳性作为V Y 9V S 2T细胞的表型特征，以胞内IFN- y分子阳性作为V Y 9V S 2T细胞分泌IFN- y细胞因子的检测标记，计算公式为: Vy 9V 8 2T细胞IFN- y分泌能力(％) =IFN- y和TCRV 8 2双阳性细胞/ TCRV 8 2单阳性细胞X 100。本专利技术的另一个目的是提供所述方法在体外诱导培养V y 9V 6 2T细胞中的应用。本专利技术通过应用IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼体外诱导VY 9V 6 2T细胞的生成，得到了诱导效率更高及活性更高的V Y 9V S 2T细胞。其具有如下特点:(I)诱导培养过程简单易行，周期短，成本低廉；(2)诱导效率高，重复性好；(3)诱导后得到的细胞活性增强，诱导培养后细胞数量和功能有望提高目前V Y 9V S 2T细胞免疫治疗肿瘤的疗效，具有很好的应用潜能。【专利附图】【附图说明】图1是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组在诱导过程第9、12、15、18天V Y 9V S 2T细胞纯度比较图。图2是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组第18天V Y 9V S 2T细胞纯度比较的统计分析图。图3是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）人单个核细胞制备：应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞，用含10%胎牛血清完全RPMI?1640培养液重悬细胞；（2）Vγ9Vδ2T细胞诱导：步骤（1）中所制备的单个核细胞接种当日按第0天计算，在第0天加入唑唻膦酸及IL?2，在第1天加入达沙替尼，接着于第3、6、9、12、15、18天进行半量换液，每次换液时加入新鲜IL?2及达沙替尼；（3）Vγ9Vδ2T细胞扩增效率检测：于第9、12、15、18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞的纯度，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，计算Vγ9Vδ2T细胞占外周血单个核细胞的百分含量；采用细胞计数仪检测活细胞密度，并根据以下公式计算Vγ9Vδ2T细胞的绝对数量：Vγ9Vδ2T细胞绝对数量=?Vγ9Vδ2T细胞纯度×活细胞密度×总体积；（4）诱导的Vγ9Vδ2T细胞表面活化分子及死亡受体检测：于第18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞表面活化分子CD69、HLA?DR及死亡受体Fas分子表达的比例，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，计算公式为：Vγ9Vδ2T细胞CD69/HLA?DR/?Fas表达（%）=?CD69/HLA?DR/Fas和TCRVδ2双阳性细胞/?TCRVδ2单阳性细胞×100；（5）诱导的Vγ9Vδ2T细胞效应型亚群比例检测：于第18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞的功能亚型分布，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，以CD27分子为区分效应型亚群的表型特征，计算公式为：Vγ9Vδ2T细胞效应型亚群比例（%）=?CD27阴性TCRVδ2阳性细胞/?TCRVδ2单阳性细胞×100；（6）诱导的Vγ9Vδ2T细胞对肿瘤细胞的的穿孔素、颗粒酶释放效应检测：于第18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞与急性髓系白血病细胞株K562共同孵育4个小时后检测Vγ9Vδ2T细胞对AML细胞刺激的穿孔素、颗粒酶释放效应，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，以CD107a分子阳性作为穿孔素、颗粒酶释放效应的检测标记，计算公式为：Vγ9Vδ2T细胞穿孔素、颗粒酶释放效应（%）=?CD107a和TCRVδ2双阳性细胞/?TCRVδ2单阳性细胞×100；（7）诱导的Vγ9Vδ2T细胞干扰素?γ细胞因子分泌能力检测：于第18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞在PMA/离子霉素刺激4个小时后检测Vγ9Vδ2T细胞干扰素?γ细胞因子的分泌能力，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，以胞内干扰素?γ分子阳性作为Vγ9Vδ2T细胞分泌干扰素?γ细胞因子的检测标记，计算公式为：????Vγ9Vδ2T细胞IFN?γ分泌能力（%）=干扰素?γ和TCRVδ2双阳性细胞/?TCRVδ2单阳性细胞×100。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄河，吴康妮，胡永仙，盛立霞，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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