从胃癌组织中高效分选单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种人类胃癌组织单细胞悬液制备及利用新型免疫磁珠高效分选单核细胞性骨髓来源抑制细胞的方法。分选方法包括：机械法剪碎所取胃癌组织；使用特殊的200目尼龙网结合负压抽吸装置组成的过滤单元获取单细胞悬液；使用Ficoll-Paque双层梯度密度离心法纯化单细胞悬液；运用新型CD14+正选免疫磁珠分选人类胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞，并通过功能学实验验证所获单核样骨髓来源免疫抑制细胞通过抑制T细胞免疫，参与人类胃癌免疫逃避机制。本发明专利技术提供一种高效的免疫分选方法；率先从人类胃癌中分选出单核样骨髓来源免疫抑制细胞并证实其免疫抑制功能，为胃癌以及多种人类肿瘤的研究提供了新的依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种胃癌组织单细胞悬液制备方法及利用新型免疫磁珠高效分选单细胞悬液中单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法。
技术介绍
骨髓来源免疫抑制细胞(1030是一群未成熟的骨髓细胞，从其首次被报道至今，越来越多的研究表明此群细胞在肿瘤的免疫逃避机制中起到了重要的作用。在正常人群中，骨髓细胞在正常生理条件下分化成为前体粒细胞，前体单核细胞，并最终分化成为成熟的粒细胞，巨噬细胞和树突状细胞。然而在肿瘤等病理条件下，骨髓细胞无法正常分化为成熟细胞，而分化为具有免疫抑制功能的一群细胞，也就是骨髓来源免疫抑制细胞(1030，研究表明，该群细胞根据其特异性表形及功能学特点可分为粒细胞样骨髓来源免疫抑制细胞及单核样骨髓来源免疫抑制细胞。 骨髓来源免疫抑制细胞(1030主要通过多种途径抑制I细胞的激活与增殖，从而产生免疫抑制的作用。在此过程中粒细胞样和单核细胞样骨髓来源免疫抑制细胞是通过不同的机制抑制I细胞的免疫功能的。目前的研究认为根据0)14的表达差异，10%可分为两个亚群:一群为表达⑶14分子的单核样骨髓来源免疫抑制细胞，另一亚群为不表达⑶14分子，但表达0)15的粒细胞样骨髓来源免疫抑制细胞。前者被认为是未成熟的骨髓细胞分化停滞于向巨噬细胞和树突状细胞分化的过程中；而后者被认为是未成熟的骨髓细胞分化停滞于向粒细胞分化的过程中，并占骨髓来源免疫抑制细胞总数的大多数。 流式细胞术对细胞的各种参数分析必须基于单细胞的基础上，根据不同实体组织成分的特点可选择不同的分散细胞的方法，以期达到单细胞产量高、细胞损伤小的目的。实体组织单细胞悬液制备方法主要有酶消化法，机械法和化学处理法。其中机械法分散实体组织与另外两种制备方法相比，操作过程简便，且具有较高的细胞存活率和检测准确性。所得单细胞更适于流式细胞术的开展。 免疫磁珠细胞分选是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法。原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱试管上，实现对目标阳性细胞分离或阴性细胞的分离纯化。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种。 为解决上述技术问题，本专利技术采用的方案是:采用机械法剪碎人类胃癌组织合并负压抽吸法及梯度密度离心法制备单细胞悬液，再运用0)14+阳性选择免疫磁珠细胞分选方法获得胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞。 本专利技术提供的一种，包括以下步骤: 步骤一:机械法剪碎所取人类胃癌标本组织； 步骤二:使用200目尼龙网结合负压抽吸装置组成的过滤单元反复操作获取单细胞悬液； 步骤三:使用双层？化011-？叫116分离液梯度密度离心法分离和纯化所获取的单细胞悬液； 步骤四:采用0)14+阳性选择免疫磁珠细胞分选方法获得人类胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞。 通过功能学实验将所获得的单核样骨髓来源免疫抑制细胞与正常人外周血0)4+丁细胞共培养，进一步证实该群细胞具有抑制I细胞免疫功能，参与人类胃癌免疫逃避机制。 在单细胞悬液的制备操作中使用机械法剪碎法相对研磨法适用于人类胃癌组织标本。 本专利技术方法包括将0)14+阳性选择免疫磁珠细胞分选方法用于人类胃癌组织单核样骨髓来源免疫抑制细胞的分选及纯化。 本专利技术的有益效果:使用机械法剪碎人类胃癌细胞组织并通过负压抽吸法制备单细胞悬液，操作简便易行，且在保证单细胞得率高的同时，将操作过程给细胞带来的损伤降到了最低，使细胞维持原有的形态及功能，有利于进一步的科学研究；通过运用新型0)14+阳性选择免疫磁珠分选人类胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞，操作简便，所获得细胞纯度高；通过功能学研究证实该群细胞具有抑制人类I细胞免疫，从而促进肿瘤的免疫逃避，为胃癌以及多种人类肿瘤的免疫学研究提供了新的依据。 【附图说明】 图1是用负压抽吸装置制备单细胞悬液示意图； 其中3是负压抽吸装置中使用的无菌200目尼龙滤网； 13是负压抽吸装置中使用的5001无菌离心管； 0是负压抽吸装置中使用的5001无菌注射器； 八操作是通过持续抽吸无菌注射器提供离心管内有效负压； 图2八，28是通过流式细胞术验证所获人类胃癌组织中分选所得单核样骨髓来源免疫抑制细胞抑制了正常⑶4+1细胞11-2的表达； 图3八，38是通过流式细胞术验证所获人类胃癌组织中分选所得单核样骨髓来源免疫抑制细胞抑制了正常⑶4+1细胞V的表达； 【具体实施方式】 下面结合附图和【具体实施方式】对本专利技术作进一步详细说明。 实施例1 本专利技术从人类胃癌组织中分选单核样骨髓来源免疫抑制细胞的操作系统包括以下步骤: (1)机械法剪碎所取人类胃癌标本组织； (2)使用200目尼龙网结合负压抽吸装置组成的过滤单元反复操作获取单细胞悬液； (3)使用双层？1(3011-？叫116分离液梯度密度离心法分离和纯化所获取的单细胞悬液； (4)运用新型0)14+阳性选择免疫磁珠细胞分选方法获得人类胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞。 (5)通过功能学实验将所获得的单核样骨髓来源免疫抑制细胞与正常人外周血0)4+1细胞共培养，进一步证实该群细胞具有抑制I细胞免疫功能，参与人类胃癌免疫逃避机制。 在单细胞悬液的制备操作中使用机械法剪碎法相对研磨法适用于人类胃癌组织标本。 本操作系统包括将新型0)14+阳性选择免疫磁珠细胞分选方法用于人类胃癌组织单核样骨髓来源免疫抑制细胞的分选及纯化。 实施例2 人类胃癌组织中单核样骨髓来源免疫抑制细胞的分选及功能学验证。 1.1肿瘤组织和瘤旁正常组织中提取制作单细胞悬液 (1)直接在手术室内切取癌组织与癌旁组织标本，要求无菌，体积相当。分别放入无菌密闭容器中(无菌？83液含2%胎牛血清浸泡)，及时带回进行处理。 (2)在无菌操作台上，将标本放入无菌器皿，用含两性霉素8(5^1 8/01)和双抗(1%)的无菌？83液冲洗，去除脂肪及坏死组织，然后用含两性霉素8 (50 0 、胎牛血清(10% )、双抗(5% )的无菌？防液浸泡1001118。 (3)在新的无菌器皿中，用无菌剪刀将组织粉碎至细糊状，要求室温下 (4)用无菌吸管将所得混合液移至含有200目尼龙滤网的负压吸引装置对细胞悬液进行过滤2次，装置及操作如图1 ； (5)离心过滤悬液，41^，180011)111，61111118 (6)弃上清，无菌？83重悬，再用无菌滤网过滤2次，离心滤过后的悬液，41，18001*^)111 ；6111；1110 (7)弃上清，1501无菌？83液重悬，震荡混匀备用。 注:癌组织与癌旁正常组织均以此法提取实验所需的单细胞悬液 1.2肿瘤组织及瘤旁组织浸润白细胞提取(双层？1(3011-？叫116分离液梯度密度离心法) 由于肿瘤组织及瘤旁组织中浸润的各类白细胞与肿瘤细胞的密度不尽相同，因此可用双层叫116分离液梯度密度离心法分离所需白细胞。 (1)取5001无菌离心管，先加1501 100%叫116分离液，然后倾斜45。，沿管壁加入1501 75% ？10011~？^116分离液，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从胃癌组织中高效分选单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法，包括以下步骤：步骤一：机械法剪碎所取人类胃癌标本组织；步骤二：使用200目尼龙网结合负压抽吸装置组成的过滤单元反复操作获取单细胞悬液；步骤三：使用双层Ficoll‑Paque分离液梯度密度离心法分离和纯化所获取的单细胞悬液；步骤四：采用CD14+阳性选择免疫磁珠细胞分选方法获得人类胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞。

【技术特征摘要】
1.一种从胃癌组织中高效分选单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法，包括以下步骤: 步骤一:机械法剪碎所取人类胃癌标本组织； 步骤二:使用200目尼龙网结合负压抽吸装置组成的过滤单元反复操作获取单细胞悬液； 步骤三:使用双层Ficoll-Paque分离液梯度密度离心法分离和纯化所获取的单细胞悬液； 步骤四:采用CD14+阳性选择免疫磁珠细胞分选方法获得人类胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用机械法获...

【专利技术属性】
技术研发人员：王国斌，李钢，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北;42