一种优化的从幼稚T细胞诱导扩增调节性T细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种优化的从幼稚T细胞诱导扩增调节性T细胞的方法，该方法的步骤包括：(1)anti‐CD3抗体包被；(2)外周血单个核细胞的分离；(3)磁珠分选幼稚T细胞；(4)诱导扩增培养。本发明专利技术的方法操作简便、安全有效、扩增诱导周期较短、稳定性较好、成本经济。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，涉及一种细胞体外扩增方法，具体地涉及一种优化的从幼稚T细胞诱导扩增调节性T细胞的方法。
技术介绍
免疫耐受是指免疫活性细胞接触抗原性物质时所表现出的一种主动的不应答状态，是一种有别于免疫缺陷和免疫抑制生物学现象。免疫耐受不良与多种疾病相关，如自身免疫性疾病、移植物抗宿主病(graftversushostdisease,GVHD)和母胎免疫排斥等。在器官或组织移植中，传统的免疫抑制药物虽能显著延长移植物的存活时间，但其伴随的副作用是患者整体免疫功能下降、感染机会增加，并可能诱发肿瘤等，极大地限制了临床器官移植的进一步发展；在母胎免疫排斥所导致的复发性流产等疾病中，使用免疫抑制药物治疗可能对胎儿生长发育造成潜在的不良影响。因此细胞靶向性诱导免疫耐受日益受到重视。通过体外诱导的方式，扩增一种安全有效、半衰期长、甚至注入体内后具有再生能力的，能诱导特异性免疫耐受的细胞具有广阔的应用前景。调节性T细胞(regulatoryTcells,Treg)是一大类具有免疫调节和抑制功能的T细胞亚群，它参与并维持机体的免疫自稳，其数量和功能的稳定与肿瘤逃逸、自身免疫性疾病、X连锁隐性遗传病IPEX(免疫调节异常，多内分泌腺病，肠病，X连锁综合征)、移植物抗宿主病(GVHD)和妊娠免疫耐受等密切相关。根据来源不同，Treg可分为两大类：(1)天然型调节性T细胞(naturalTreg,nTreg)：成熟于胸腺，表达CD25分子和Foxp3，约占外周CD4+T细胞的5％‐10％；(2)诱导型调节性T细胞(inducedTreg,iTreg)：在不完全暴露抗原刺激和/或联合刺激的特定条件下，由幼稚T细胞(Tcells)在体内周围组织中激活扩增而来。nTreg和iTreg虽然来源不同，但其表型和免疫学功能相似，均以表达核转录因子Foxp3为最主要特征，表达CTLA‐4、ICOS及OX‐40等表面分子，分泌IL‐10、TGF‐β等细胞因子，通过多种途径抑制效应T细胞的免疫应答并促进抑制型细胞因子分泌，维持机体内环境的免疫自稳、诱导宿主对移植物的免疫耐受，是机体以主动方式获得并维持自身免疫耐受的重要方式。近来，过继转移实验研究显示，CD4+、CD25+Treg可以推迟甚至治疗同种异体移植物排斥反应。在动物模型中，IgG介导扩增调节性T细胞表位组合物可预防、治疗甚至治愈自身免疫疾病的小鼠。对Treg的基础和临床研究，尤其是临床应用潜能的研究是基础医学和免疫学的研究热点。然而，nTreg仅占正常人周围血CD4+T细胞的5‐15％，大大地限制了其临床应用。在已报道的Treg扩增方法中，iTreg多存在以下问题：使用anti‐CD3/CD28‐磁珠作为诱导剂，扩增成本高；使用异种或异体血清，具有潜在生物安全问题；需要多次分选，操作复杂且增加成本；此外，还存在扩增诱导周期较长、稳定性欠佳等其他问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种从幼稚T细胞诱导扩增调节性T细胞的方法，该方法操作简便、安全有效、扩增诱导周期较短、稳定性较好、成本经济。为实现以上目的，本专利技术提供了一种优化的从幼稚T细胞诱导扩增调节性T细胞的方法，该方法的步骤包括：(1)anti‐CD3抗体包被：细胞培养，在24孔培养板中每孔加入含0.1‐2μg/mlanti‐CD3抗体的PBS1mL置于4℃孵育1h至24h备用，其他孔板根据体积或底面积换算；(2)外周血单个核细胞的分离：抽取肝素抗凝静脉血20ml，取3支15ml管离心管，每管加入淋巴细胞分离液4ml，将6‐7mL外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，800g离心17min，分别收集血浆和外周血单个核细胞，血浆56℃水浴灭活补体，外周血单个核细胞加入足量的生理盐水洗涤1‐2次；(3)磁珠分选幼稚T细胞：将所述步骤(2)中获得的外周血单个核细胞进行计数，加PBS洗涤，用美天旎磁珠阴性分选幼稚T细胞；每107细胞以40μlbuffer重悬，加入10μlCD4+TCellBiotin‐AntibodyCocktailII抗体，混匀后4℃孵育5min；加入30μlbuffer、20μl的NaiveCD4+TCellMicroBeadCocktailII磁珠，混匀后4℃孵育10min，得到细胞混合液；用3‐5mlbuffer平衡LD型细胞分选柱，将所得的细胞混合液加入平衡后的LD型细胞分选柱，用3‐5mlbuffer洗涤装有细胞混合物的离心管后加入细胞分选柱，收集过柱后的细胞悬液，得到阴选的未被抗体结合的细胞，即幼稚T细胞；(4)诱导扩增培养：将包被anti‐CD3的培养板从4℃取出于置于37℃培养箱平衡；吸去PBS；将幼稚T细胞重悬于Treg诱导培养基，调整至0.2‐2×106/孔接种于包被anti‐CD3的培养板。作为一种优选的实施方式，所述Treg诱导培养基的配方比例为：已添加2.06mMGlutamax‐I和25mMHEPESbuffer的RPMI1640培养基，向所述RPMI1640培养基中加入10％v/v自体血清，并加入终浓度为200U/ml重组人IL‐2、1‐5ng/ml重组人TGF‐β1、0.1‐10μg/mlanti‐CD28、10‐200nM雷帕霉素。作为一种优选的实施方式，所述方法还包括Treg细胞传代步骤，在该步骤中，根据细胞情况，离心计数细胞数，将其重悬于所述Treg诱导培养基中，调整至0.2‐2×106/孔，接种于另一个包被anti‐CD3的24孔板。作为一种优选的实施方式，所述方法还包括Treg细胞冻存步骤，在该步骤中，所述冻存液的配方如下：向已添加2.06mMGlutamax‐I和25mMHEPESbuffer的RPMI1640培养基中，按体积百分比(v:v)加入10％DMSO和20％自体血清。作为一种优选的实施方式，所述方法还包括Treg细胞复苏步骤，在该步骤中，于37℃水浴复苏细胞，使用5ml的所述Treg诱导培养基洗涤细胞后，重悬于所述Treg诱导培养基中，调整至0.2‐2×106/孔接种于包被anti‐CD3的24孔板中。本专利技术的方法采用预包被的anti‐CD3抗体的培养板作为扩增诱导剂；在使用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)的同时，吸取上层自体血清作为Treg培养血清，从而避免了同种异体血清和异种血清潜在的生物安全问题及免疫排异反应，并且节约了商品血清成本；此外，本专利技术仅在培养开始阶段用磁珠阴性分选幼稚T细胞，培养过程不需要进行多次分选，从而降低成本，减少污染机会和对细胞的损伤和消耗，节省操作时间；本专利技术还进一步标准化了每个培养孔的细胞数、培养基量和刺激剂浓度、治疗时间和治疗的细胞总数、细胞浓度，使扩增和治疗效果更为稳定。利用表型和功能实验验证体外扩增Treg的扩增效率和纯度，实验结果表明，本专利技术方法的扩增诱导周期是12‐21天，Treg细胞纯度达到85％以上。附图说明图1示出了Treg抑制功能实验的操作示意图。图2示出了使用根据本专利技术的方法诱导增殖后的调节性T细胞的生长情况。图3示出了Treg表型和CD25、CD127、Foxp3表达的流式分析结果。图4示出了Treg表型和IL‐10、TGF本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种优化的从幼稚T细胞诱导扩增调节性T细胞的方法，该方法的步骤包括：(1)anti‐CD3抗体包被：细胞培养，在24孔培养板中每孔加入含0.1‐2μg/ml anti‐CD3抗体的PBS 1mL置于4℃孵育1h至24h备用，其他孔板根据体积或底面积换算；(2)外周血单个核细胞的分离：抽取肝素抗凝静脉血20ml，取3支15ml管离心管，每管加入淋巴细胞分离液4ml，将6‐7mL外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，800xg离心17min，分别收集血浆和外周血单个核细胞，血浆56℃水浴灭活补体，外周血单个核细胞加入足量的生理盐水洗涤1‐2次；(3)磁珠分选幼稚T细胞：将所述步骤(2)中获得的外周血单个核细胞进行计数，加PBS洗涤，用美天旎磁珠阴性分选幼稚T细胞；每107细胞以40μl buffer重悬，加入10μlCD4+T Cell Biotin‐Antibody Cocktail II抗体，混匀后4℃孵育5min；加入30μl buffer、20μl的Naive CD4+T Cell Micro Bead Cocktail II磁珠，混匀后4℃孵育10min，得到细胞混合液；用3‐5ml buffer平衡LD型细胞分选柱，将所得的细胞混合液加入平衡后的LD型细胞分选柱，用3‐5ml buffer洗涤装有细胞混合物的离心管后加入所述细胞分选柱，收集过柱后的细胞悬液，得到阴选的未被抗体结合的细胞，即幼稚T细胞；(4)诱导扩增培养：将包被anti‐CD3的培养板从4℃取出于置于37℃培养箱平衡；吸去PBS；将幼稚T细胞重悬于Treg诱导培养基，调整至0.2‐2×106/孔接种于包被anti‐CD3的培养板。...

【技术特征摘要】
1.一种优化的从幼稚T细胞诱导扩增调节性T细胞的方法，该方法的步骤包括：(1)anti‐CD3抗体包被：细胞培养，在24孔培养板中每孔加入含0.1‐2μg/mlanti‐CD3抗体的PBS1mL置于4℃孵育1h至24h备用，其他孔板根据体积或底面积换算；(2)外周血单个核细胞的分离：抽取肝素抗凝静脉血20ml，取3支15ml管离心管，每管加入淋巴细胞分离液4ml，将6‐7mL外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，800xg离心17min，分别收集血浆和外周血单个核细胞，血浆56℃水浴灭活补体，外周血单个核细胞加入足量的生理盐水洗涤1‐2次；(3)磁珠分选幼稚T细胞：将所述步骤(2)中获得的外周血单个核细胞进行计数，加PBS洗涤，用美天旎磁珠阴性分选幼稚T细胞；每107细胞以40μlbuffer重悬，加入10μlCD4+TCellBiotin‐AntibodyCocktailII抗体，混匀后4℃孵育5min；加入30μlbuffer、20μl的NaiveCD4+TCellMicroBeadCocktailII磁珠，混匀后4℃孵育10min，得到细胞混合液；用3‐5mlbuffer平衡LD型细胞分选柱，将所得的细胞混合液加入平衡后的LD型细胞分选柱，用3‐5mlbuffer洗涤装有细胞混合物的离心管后加入所述细胞分选柱，收集过柱后的细胞悬液，得到阴选的未被抗体结合的细胞，即幼稚T细胞；(4)诱导扩增培养：将包被anti‐CD3的培养板从4℃取出于置...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁梁辉，黄春宇，李玉叶，连若纯，林嘉音，何来宾，张谞，陈聪，
申请(专利权)人：深圳中山生殖与遗传研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44