体外扩增γδT细胞的培养基和方法技术

本发明专利技术公开了体外扩增γδT细胞的培养基和方法。本发明专利技术公开的培养基含有L‑谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的哺乳动物细胞无血清培养基，各组分在培养基中的浓度依次为1.45‑2.55mM、5.5‑9.5mg/L、5.5‑9.5mg/L、0.3‑0.5％(v/v)、1.0×105‑3.0×105IU/L、5.0‑15.0μg/L、0.5‑1.5mg/L、0.5‑1.5μmol/L。利用本发明专利技术的培养基培养的人γδT细胞，细胞生长速度快、数量多、纯度高、对肿瘤细胞的杀伤力强，活性稳定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，体外扩增γδT细胞的培养基和方法。
技术介绍
肿瘤是由于机体的免疫功能不足以战胜各种致病因素而造成的，其发生、发展与宿主的免疫状态有着密切的关系。近几十年来，手术、化疗及放疗已成为临床上治疗肿瘤的主要手段，并取得了一定的治疗效果，但目前肿瘤的复发率和死亡率仍然较高，主要与肿瘤细胞对化学药物或放射线形成耐受有关。新型的肿瘤细胞免疫治疗技术通过恢复和增强肿瘤患者的免疫监视能力和免疫杀伤功能，可以清除手术和放化疗后患者体内残存的肿瘤细胞，达到预防肿瘤复发、转移及根治肿瘤的目的，并且具有特异性强、毒副作用小等特点，被称为第四大肿瘤治疗模式。根据免疫细胞治疗的特点及抗肿瘤的机制，细胞免疫治疗可分为主动性免疫治疗和过继性细胞免疫治疗；又可分为特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗。国内外一些临床试验研究发现，特异性细胞治疗技术、基因修饰的T细胞技术、非特异性细胞治疗技术在临床肿瘤治疗中均取得了较为肯定的疗效。国际上已批准一些过继性细胞产品用于临床肿瘤的治疗，2010年美国FDA批准了首个个体化细胞治疗产品—前列腺癌治疗性疫苗(Provenge)应用于临床治疗，现在已有多个膀胱癌、结肠癌、黑色素瘤、肾细胞癌等的治疗性肿瘤疫苗在美国、法国、俄罗斯、荷兰等国上市销售，日本厚生省将肿瘤细胞免疫疗法(αβT细胞、NK细胞、NKT细胞、DC细胞等)列为临床常规治疗方法，韩国FDA批准了Immuncell-LC(αβT细胞)产品用于临床治疗。目前，我国特异性细胞治疗仍处于技术研究阶段，非特异性细胞治疗技术虽在临床应用了近30年，但至今还没出现过一个真正意义上的肿瘤细胞免疫治疗产品。如何获得体外扩增能力强、杀瘤识别谱广、抗癌杀伤力高、毒副作用小的免疫细胞，并用于肿瘤患者的临床治疗，已成为肿瘤细胞免疫治疗领域的研究重点。γδT细胞只表达γδTCR，与αβT细胞不同，是一群非经典的T细胞，γδT细胞杀伤肿瘤细胞不需要特异性肿瘤抗原的刺激并无MHC限制性，在体内和体外均有较好的抗肿瘤效应并具有多种生物学功能。γδT细胞在抗肿瘤免疫中为连接天然免疫和适应性免疫的桥梁，是肿瘤细胞免疫治疗强有力的工具。活化后的γδT细胞可以对多种肿瘤表现出细胞毒活性，作用机制包括穿孔素/颗粒酶，ADCC(CD16)、Fas配体，或肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)等细胞死亡诱导方式，并能产生大量的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-17F、IL-22等。已有临床研究表明，利用γδT细胞治疗淋巴系统的肿瘤、黑色素瘤及结肠癌等实体瘤取得了较好的治疗效果，体外扩增的γδT细胞具有稳定的抗肿瘤活性，对于体内γδT细胞数量极少或γδT细胞功能严重缺陷的肿瘤患者来说，使用体外扩增的γδT细胞进行治疗对控制病情具有重要意义。因此，体外扩增足够数量的γδT细胞并用于恶性肿瘤的临床治疗具有重要的科学和应用价值。建立规范的自体γδT细胞体外扩增、临床应用及质量控制体系等，将给肿瘤患者的根治疗带来新的希望，延长患者的生存期，提高患者的生存质量。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何体外扩增人γδT细胞。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于体外扩增γδT细胞的培养基。本专利技术所提供的用于体外扩增γδT细胞的培养基，为含有L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的哺乳动物细胞无血清培养基。上述培养基中L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、所述血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的浓度分别可为1.45mM-2.55mM的L-谷氨酰胺、5.5mg/L-9.5mg/L的核糖核苷、5.5mg/L-9.5mg/L的脱氧核糖核苷、0.3％-0.5％(v/v)的所述血浆、1.0×105IU/L-3.0×105IU/L的人白细胞介素2、5.0μg/L-15.0μg/L的人白细胞介素7、0.5mg/L-1.5mg/L的植物血凝素、0.5μmol/L-1.5μmol/L的唑来膦酸。上述培养基中，所述核糖核苷可为腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷。上述培养基中，所述脱氧核糖核苷可为腺嘌呤脱氧核糖核苷、鸟嘌呤脱氧核糖核苷、胞嘧啶脱氧核糖核苷和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷。上述培养基中，所述核糖核苷中腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷的质量比可为1：1：1：1。上述培养基中，所述脱氧核糖核苷中腺嘌呤脱氧核糖核苷、鸟嘌呤脱氧核糖核苷、胞嘧啶脱氧核糖核苷和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷的质量可比为1：1：1：1。上述培养基中L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、所述血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的浓度可为下述1)或2)或3)：1)2.0mM的L-谷氨酰胺、7.0mg/L的核糖核苷、7.0mg/L的脱氧核糖核苷、0.4％(体积百分比)所述血浆、2.0×105IU/L的人白细胞介素2、10.0μg/L的人白细胞介素7、1.0mg/L的植物血凝素和1.0μmol/L的唑来膦酸；2)1.45mM的L-谷氨酰胺、5.5mg/L的核糖核苷、5.5mg/L的脱氧核糖核苷、0.3％(体积百分比)的所述血浆、1.0×105IU/L的人白细胞介素2、5.0μg/L的人白细胞介素7、0.5mg/L的植物血凝素和0.5μmol/L的唑来膦酸；3)2.55mM的L-谷氨酰胺、9.5mg/L的核糖核苷、9.5mg/L的脱氧核糖核苷、0.5％(体积百分比)的所述血浆、3.0×105IU/L的人白细胞介素2、15.0μg/L的人白细胞介素7、1.5mg/L的植物血凝素和1.5μmol/L的唑来膦酸。上述培养基中，所述血浆与所述γδT细胞可来源于同一个动物个体。上述培养基可为向GT-T551H3培养基中添加L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、所述血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸得到的培养基。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了体外扩增γδT细胞的方法。本专利技术所提供的体外扩增γδT细胞的方法，包括利用所述培养基培养血液中细胞，完成γδT细胞的扩增。上述方法中，所述培养的温度可为36℃-37℃。上述方法中，所述培养的空气中CO2体积百分比含量可为4.0％-10.0％(如5.0％)。上述方法中，所述培养的空气湿度可为饱和湿度。上述方法中，所述培养的体系中细胞的浓度可为(1.5-3)×106个/ml。所述培养的体系中细胞的浓度具体可为(1.5-2)×106个/ml或(2-3)×106个/ml。所述培养的体系中细胞的浓度具体是指γδT细胞的浓度，该细胞浓度可利用所述γδT细胞培养液进行调整。上述方法中，所述血浆与所述血液中细胞均可来源于同一个动物个体。上述方法中，所述血液中细胞可为外周血单个核细胞。上述方法中，所述动物可为下述a1)或a2)：a1)哺乳动物；a2)人。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了下述1)或2)或3)：1)体外扩增γδT细胞的产品，包括所述培养基和人外周血单个核细胞；2)用于体外扩增γδT细胞的成套试剂，由本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于体外扩增γδT细胞的培养基，其特征在于：所述培养基为含有L‑谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的哺乳动物细胞无血清培养基。

【技术特征摘要】
1.用于体外扩增γδT细胞的培养基，其特征在于：所述培养基为含有L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的哺乳动物细胞无血清培养基。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基中L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的浓度分别为1.45mM-2.55mM的L-谷氨酰胺、5.5mg/L-9.5mg/L的核糖核苷、5.5mg/L-9.5mg/L的脱氧核糖核苷、0.3％-0.5％(v/v)的血浆、1.0×105IU/L-3.0×105IU/L的人白细胞介素2、5.0μg/L-15.0μg/L的人白细胞介素7、0.5mg/L-1.5mg/L的植物血凝素、0.5μmol/L-1.5μmol/L的唑来膦酸。3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述核糖核苷为腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷；和/或，所述脱氧核糖核苷为腺嘌呤脱氧核糖核苷、鸟嘌呤脱氧核糖核苷、胞嘧啶脱氧核糖核苷和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷。4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述核糖核苷中腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷的质量比为1：1：1：1；和/或，所述脱氧核糖核苷中腺嘌呤脱氧核糖核苷、鸟嘌呤脱氧核糖核苷、胞嘧啶脱氧核糖核苷和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷的质量比为1：1：1：1。5.根据权利要求1-4中任一所述的培养基，其特征在于：所述培养基中L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、所述血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的浓度为下述1)或2)或3)：1)2.0mM的L-谷氨酰胺、7.0mg/L的核糖核苷、7.0mg/L的脱氧核糖核苷、0.4％(体积百分比)所述血浆、2.0×105IU/L的人白细胞介素2、10.0μg/L的人白细胞介素7、1.0mg/L的植物血凝素和1.0μmol/L的唑来膦酸；2)1.45mM的L-谷氨酰胺、5.5mg/L的核糖核苷、5.5mg/L的脱氧核糖核苷、0.3％(体积百分比)的所述血浆、1.0×105IU/L的人白细胞介素2、5.0μg/L的人白细胞介素7、0.5mg/L的植物血凝素和0.5μmol/L的唑来膦酸；3)2.55mM的L-谷氨酰胺、9.5mg/L的核糖核苷、9.5mg/L的脱氧核糖核苷、0.5％(体积百分比)的所...

【专利技术属性】
技术研发人员：程民，胡世莲，陈稳，沈干，沈国栋，徐婷娟，
申请(专利权)人：安徽省立医院，
类型：发明
国别省市：安徽;34