本发明专利技术提供了一种扩增CIK细胞且提高其特异性杀瘤的培养方法，所述的方法包括分离获得单个核细胞，将其转至培养瓶中，加入终浓度为400-600ng/ml CD3mAb、1400-1600 ng/ml CD28mAb、4000-4800IU/ml IFN-γ、4000-4800IU/ml IL-2、140-160ng/ml IL-15，第4天补加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液，第6天分瓶培养，第8、9天分别将瓶中的细胞转至1.8L细胞培养袋内，补加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液，第11天将细胞分袋培养补加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鲜培养液，继续诱导扩增，第15-21天内收获细胞；将收获的细胞用抗EGFR×抗CD3双功能抗体常温下孵育30-40分钟后，用生理盐水洗涤后收集细胞，即制成特异性杀瘤的CIK细胞制剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种有效扩增CIK细胞且提高其特异性杀瘤的方法。
技术介绍
恶性肿瘤是继心血管疾病之后的危害人类健康的第二号杀手，近年来，肿瘤的发生率和死亡率呈逐年上升的趋势，且肿瘤发病成年轻化趋势。随着分子生物学和免疫学等学科的快速发展，肿瘤的生物免疫治疗已成为继手术、放疗、化疗之后的第四种疗法。其中，肿瘤过继性免疫细胞治疗成为当前研究的热点，其是指将人体外扩增的具有抗肿瘤活性的免疫细胞回输至患者体内，从而直接或间接激发机体免疫应答以杀伤肿瘤细胞的一种细胞疗法。它具有个体性、安全性、靶向性和高效性等优势。细胞因子诱导的杀伤性细胞(Cytokine-InducedKillercells，CIK)属于肿瘤过继性免疫细胞治疗中的一种，由美国斯坦福大学的SchmidtWolf于1991年首次报道，他们发现人外周血单个核细胞于多种细胞因子(如IFN-γ、抗CD3McAb、IL-1α和IL-2)作用一段时间后，被定向诱导并大量增殖成为可同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子,且兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点的异质细胞群。CIK细胞具有体外增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、不良反应少、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、可提高患者免疫功能等特点，是临床应用中的一类较为理想的效应细胞，被认为是肿瘤过继免疫治疗的希望。然而，此类效应细胞在人正常外周血中数量极少，仅占1％～5％。目前，人们虽能通过常规的CIK制备方法获得一定数量的CIK细胞，但获得的CIK细胞的细胞毒性和增殖倍数均不够理想。由此可见，如何获得数量足够、细胞毒性强的效应细胞是保证治疗效果的必备条件。此外，CIK细胞的一个特点是杀瘤谱广，意味着它的特异性杀瘤能力较差，就某种特定的肿瘤而言，如表皮生长因子受体（EGFR）阳性肿瘤，如何提高其特异性杀伤EGFR阳性肿瘤细胞的能力是提升CIK细胞治疗效果所不得不考虑的又一个现实问题。EGFR对肿瘤的生长、发展及肿瘤干细胞的维持都有着非常重要的作用，且在多种实体瘤中存在过表达或异常表达，因此在本专利研究中可作为一个重要的靶标。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种有效扩增CIK且提高其特异性杀瘤能力的方法，解决了目前获得的CIK细胞的增殖倍数不够理想；CIK诱导过程中需持续补充各种细胞因子，较为繁琐；CIK细胞广谱杀瘤的特点所导致其特异性杀瘤能力弱等缺点。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：用Ficoll淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞，将其转至T175培养瓶中，加入CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ、IL-2、IL-15，第4天补加IL-2和IL-15，第6天分瓶培养，第8、9天分别将瓶中的细胞转至1.8L细胞培养袋内，补加IL-2和IL-15，第11天将细胞分袋培养，补加IL-2和IL-15，继续诱导扩增，第15-21天内收获细胞。将收获的细胞用一种抗EGFR×抗CD3双功能抗体常温下孵育30-40分钟后，用生理盐水洗涤后收集细胞，即可制成特异性杀伤EGFR阳性肿瘤细胞的CIK细胞制剂。无菌采集健康人或患者外周血60ml，2小时内运送到实验室制备，在洁净区进行PBMC的分离和CIK的体外培养。全血经微生物免疫检测合格后方可进行后续分离培养操作。1.单核细胞（PBMC）分离（a）取500ul外周血用血细胞分析仪计数、活性检测：将外周血与生理盐水等体积混合，之后加入40mlFicoll淋巴细胞分离液离心分离单核细胞；离心参数：1600rpm、20摄氏度、20分钟；（b）取白膜，加入生理盐水至总体积80ml，离心洗涤两次；离心参数：2000rpm、20摄氏度、8分钟；（c）细胞用无血清基础培养基重悬细胞沉淀，利用细胞计数仪进行细胞计数，计算细胞得率。2.CIK诱导培养（1）分离的PBMC计数后，按8-10×105个/ml密度接种于T175培养瓶中，补加终浓度400-600ng/mlCD3mAb、1400-1600ng/mlCD28mAb、4000-4800IU/mlIFN-γ、4000-4800IU/mlIL-2、140-160ng/mlIL-15，补充无血清培养基至50ml。（2）第3天，细胞计数，加入600-1000IU/mlIL-2、20-30ng/mlIL-15的新鲜培养液50ml。（3）第4天，细胞计数，加入600-1000IU/mlIL-2、20-30ng/mlIL-15的新鲜培养液50ml。（4）第6天分瓶培养，细胞计数，将原培养瓶中的细胞悬液混匀后按体积比1.4:1分别转移至两新T175培养瓶中，分别标记为a.b和c.d，两瓶分别补加600-1000IU/mlIL-2、20-30ng/mlIL-15的新鲜培养液至240ml；（5）第8天装袋培养，细胞计数，将a.b培养瓶中细胞悬液装入1.8L细胞培养袋（袋a）中，补加600-1000IU/mlIL-2、20-30ng/mlIL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。（6）第9天装袋培养，细胞计数，将c.d培养瓶中细胞悬液装入1.8L细胞培养袋（袋c）中，补加600-1000IU/mlIL-2、20-30ng/mlIL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。（7）第11天分袋培养，细胞计数后，将原培养袋（袋a和袋c）中的细胞悬液分别按1.4:1比例分至两新培养袋（袋b和袋d）中，四个细胞培养袋分别补加600-1000IU/mlIL-2、20-30ng/mlIL-15的新鲜培养液至终体积1000ml。（8）第15、17、19、21天，细胞计数，检测细胞活性，收获细胞（袋a、袋b、袋c、袋d）。所收获的细胞分别用抗EGFR×抗CD3双功能抗体在常温下孵育30-40分钟后，用生理盐水洗涤细胞备用。3.CIK细胞对EGFR阳性肿瘤细胞的体外杀伤率（1）将抗EGFR×抗CD3双功能抗体处理组与未处理组CIK细胞与靶细胞，按5︰1、10︰1、20︰1、比例加入96孔培养板，同时设效应细胞组、靶细胞组和空白组，每组设3个平行孔，置于37℃，5％CO2，培养箱培养。（2）20h后，每孔取出100μl上清，再加入10μlCCK8，继续孵育4-6h。（3）在酶联免疫检测仪上选择450nm波长测各孔OD值。（4）平行孔平均OD值计算结果：杀伤活性(％)＝1－(实验组OD值一效应组OD值/靶细胞组OD值)×100％。本专利技术的优点在于：现有技术缺陷：最终获得的CIK本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种扩增CIK细胞且提高其特异性杀瘤的培养方法，其特征在于：所述的方法包括分离获得单个核细胞，将其转至培养瓶中，加入CD3mAb、CD28mAb、IFN‑γ、IL‑2、IL‑15，第4天补加IL‑2和IL‑15，第6天分瓶培养，第8、9天分别将瓶中的细胞转至1.8L细胞培养袋内，补加IL‑2和IL‑15，第11天将细胞分袋培养补加IL‑2和IL‑15，继续诱导扩增，第15‑21天内收获细胞；将收获的细胞用双特异性抗体常温下孵育30‑40分钟后，用生理盐水洗涤后收集细胞，即制成特异性杀瘤的CIK细胞制剂。
【技术特征摘要】
1.一种扩增CIK细胞且提高其特异性杀瘤的培养方法，其特征在于：所述的方法包括分
离获得单个核细胞，将其转至培养瓶中，加入CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ、IL-2、IL-15，第4天
补加IL-2和IL-15，第6天分瓶培养，第8、9天分别将瓶中的细胞转至1.8L细胞培养袋内，补
加IL-2和IL-15，第11天将细胞分袋培养补加IL-2和IL-15，继续诱导扩增，第15-21天内收
获细胞；将收获的细胞用双特异性抗体常温下孵育30-40分钟后，用生理盐水洗涤后收集细
胞，即制成特异性杀瘤的CIK细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的一种扩增CIK细胞且提高其特异性杀瘤的培养方法，其特征在
于：所述方法具体包括如下：
（1）单核细胞分离：
（a）取500ul外周血用血细胞分析仪计数、活性检测：将外周血与生理盐水等体积混
合，之后加入40mlFicoll淋巴细胞分离液离心分离单核细胞；离心参数：1600rpm、20摄
氏度、20分钟；
（b）取白膜，加入生理盐水至总体积80ml，离心洗涤两次；离心参数：2000rpm、20摄氏
度、8分钟；
（c）细胞用无血清基础培养基重悬细胞沉淀，利用细胞计数仪进行细胞计数；
（2）CIK诱导培养：
（a）分离的单核细胞计数后，按8-10×105个/ml密度接种于培养瓶中，补加终浓度为
400-600ng/mlCD3mAb、1400-1600ng/mlCD28mAb、4000-4800IU/mlIFN-γ、4000-
4800IU/mlIL-2、140-160ng/mlIL-15，...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖桂清，苏爱盟，
申请(专利权)人：福建省银丰干细胞工程有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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