用于减少非特异性核酸扩增的方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供了用于核酸的有效扩增的方法和试剂盒。本公开主要涉及用于所关心的靶核酸的核酸扩增的试剂盒和方法。本文描述的方法通过在扩增过程中使用新的修饰引物，减少不需要的引物二聚体结构和嵌合核酸产物的产生而促进靶核酸（即，模板核酸）的合成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于减少非特异性核酸扩增的方法和试剂盒相关申请的交叉引用本申请要求保护提交于2012年4月13日的美国专利申请第13/446,474号的优先权，该专利申请要求提交于2012年2月15日的美国临时申请第61/599,119号的权益，所述临时申请通过全文引用并入此处。专利
本公开主要涉及用于扩增所关心的靶核酸的方法和试剂盒。在这里描述的方法和组合物通过使用新引物促进所需靶核酸的扩增，从而减少不需要的扩增产物（如，引物二聚体和嵌合核酸）的产生。专利技术背景多种技术目前可以用于甚至从起始核酸模板的数个分子有效扩增核酸。这些包括聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、自持序列复制（3SR）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、链置换扩增（SDA）、多重置换扩增（MDA）和滚环扩增（RCA）。这些技术很多涉及对起始核酸模板的指数扩增并能够快速地产生大量的扩增产物。用于靶核酸的扩增的试剂盒可市购（例如，GenomiPhi™（GeneralElectric,Inc）和RepliG™（Qiagen,Inc.），但对于这些方法的改进会是有利的。核酸扩增技术常常应用于基于核酸的测定，其用于分析物的探测、传感、法医和诊断应用、基因组测序、全基因组扩增等。这类应用常常要求扩增技术具有高特异性、灵敏性、准确性和稳健性。但是，当前可用于核酸扩增的技术大多数受到高背景信号的妨害，这些高背景信号由产生不需要的扩增产物的非特异性扩增反应产生。这些非特异性扩增反应妨碍了很多这些技术在重要的基于核酸的测定中的有效应用。例如，传统扩增反应的应用可产生假阳性结果，从而导致不正确的诊断。这种非特异性的背景扩增反应在仅痕量的待扩增靶核酸可用（例如，从单一的DNA分子中扩增全基因组）时变得甚至更成问题。非特异性背景扩增反应可归因于例如样品中污染核酸序列的扩增，引物二聚体的形成，或嵌合核酸的产生（例如，产生于所需核酸产物的自杂交）。在核酸扩增反应中非特异性扩增的常见来源产生于多种不希望有的引物相互作用。引物可与靶核酸中的核酸区域杂交，或与同靶核酸的一部分具有共享某种同源性的污染核酸中的核酸区域杂交。如果引物的3'末端对于非靶定区域具有足够的同源性，这一区域可被扩增。非特性扩增也可产生于计划外的核酸模板不依赖性的引物-引物相互作用。引物可通过链内或链间引物退火（例如，分子内或分子间的杂交）形成引物二聚体结构，导致不需要的核酸的扩增。所产生的假引物延伸产物可进一步被扩增且有时可支配、抑制或掩弊所需的靶序列扩增。此外，扩增产物可自杂交，在扩增反应过程中允许核酸聚合酶产生杂交产物或嵌合产物。为引发DNA合成，目前MDA配方常常利用带有序列5'-NNNNN*N的随机六聚体，其中“N”表示脱氧腺苷（dA）、脱氧胞苷（dC）、脱氧鸟苷（dG）或脱氧胸苷（dT），“*”表示硫代磷酸酯键。不能通过分子内或分子间杂交作用交叉杂交的受限型随机化六聚体引物（例如，R6，其中R=A/G）已用于在核酸扩增过程中抑制引物二聚体结构的形成。但是，这些受限型随机化引物在核酸扩增反应中给予了相当大的偏倚。这类引物对于序列非特异性或序列非偏倚性核酸扩增反应（例如，全基因组或未知核酸序列扩增）也具有有限的应用。为引发DNA合成，MDA配方常常利用带有如下序列的随机六聚体：5'-NNNNN*N，其中“N”表示脱氧腺苷（dA），脱氧胞苷（dC），脱氧鸟苷（dG）或脱氧胸苷（dT），“*”表示硫代磷酸酯键。使竞争性非靶核酸（即，模板DNA）扩增最小化的一种解决方案是以使得抑制它们彼此退火的能力的方式修饰寡核苷酸引物。用于克服与使用上述随机六聚体引物的核酸扩增相关的问题的以前的研究包括在美国专利第7,993,839号（2011年8月9日授予）中公开的那些方法和试剂盒。此专利中描述的技术包括但不限于如下通用结构的六聚体引物的使用：5'-+W+WNNN*S-3'，其中“＋”在锁定核苷酸碱基之前（即，“LNA碱基”；例如，+A=腺苷LNA分子），“W”表示仅dA和dT的混合物，“S”表示仅dC和dG的混合物。所述“*”表示两个核苷酸间的硫代磷酸酯键。由于“W”碱基不能与“S”碱基稳定地配对，抑制了寡核苷酸双链体的形成，这导致非模板核酸的扩增减少。这些方法和试剂盒可称为“SDGenomiPhi”。当扩增痕量核酸样品时，对MDA的速度和灵敏性的一个改进是将LNA并入寡核苷酸引物。LNA是一类构象受限制的核苷酸类似物，其用于提高碱基配对的速度、效率和稳定性，从而促进修饰寡核苷酸与所关注的核酸中的其靶序列杂交。对于被并入到寡核苷酸引物中的每一个LNA单体，双链体解链温度（Tm）被提高2-8℃。双链体的Tm的提高允许在更严格条件下比如在更高的温度下或用更低的盐浓度（例如，与用于使用未修饰引物的传统扩增反应中的75mMKCl相对的15mMKCl），进行MDA反应。虽然通过将LNA并入随机引物中显著地提高了使用MDA的扩增动力学，但是一个缺点是六聚体相互之间也更有效地退火，导致不需要的核酸（例如，引物二聚体）的扩增。与非靶核酸不希望有的扩增相关的问题亦已从消除来自用于核酸扩增方法中的试剂和试剂溶液的污染核酸的角度研究解决。在美国专利申请公布第2009/0155859号中公开了制备用于核酸扩增的无核酸污染的试剂和试剂溶液的试剂盒和方法。这些方法包括处理聚合酶溶液、核苷酸溶液和引物溶液，以使污染核酸无活性。这些方法应用聚合酶和/或核酸外切酶的校正活性以消除试剂和试剂溶液中的污染。这些在美国专利申请公布第2009/0155859号中描述的方法有时可被称为“CleanGenomiPhi”或“CleanGPhi”。尽管有这些进步，但是依然存在对开发更有效的、在序列覆盖率方面有更低偏崎及产生更低水平的非特异性背景扩增的核酸扩增方法的需求。在本领域中需要开发没有序列偏崎的用于核酸扩增的引物，其也降低引物-引物相互作用，且最小化嵌合核酸（例如，由六聚体引物与靶核酸扩增产物退火产生的不需要的核酸产物）的产生。专利技术简述本专利技术提供了用于靶核酸的扩增的方法和组合物。在不意图局限于特定作用机制的情况下，认为在这里公开的方法通过使用被设计用于最小化或防止用其它核酸扩增方法和试剂盒所观察到的不需要的引物二聚体和嵌合产物的产生的修饰引物，更有效地扩增所需的靶核酸（例如，“DNA模板”或“核酸模板”）。本文所描述的方法利用新引物设计方法以避免假核酸扩增产物的产生。例如，在一个实施方案中，使含有2-氨基-脱氧腺苷(2-氨基-dA)和2-硫代-脱氧胸苷(2-硫代-dT)的随机六聚体产生并运用于核酸的扩增反应（例如，MDA）。在这里描述的方法和试剂盒可称为“ATGenomiPhi”。在本专利技术的一方面中，这些修饰六聚体具有如下通式：+N+N(atN)(atN)(atN)*N，其中如前面所述，“＋”在LNA碱基之前，(atN)表示2-氨基-dA、dC、dG和2-硫代-dT的随机混合物。用于本公开的另一个方面中的六聚体包含：(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N，其中的符号在这两个六聚体设计之间是一致的。如下面所更详细描述的，在核酸扩增技术中使用这些六聚体通过如下致力于最小化或消除与传统方法中所观察到的引物二聚体形成和嵌合核酸的本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于扩增核酸的方法，包括：a）提供核酸模板；b）使核酸模板与包含DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和具有3'末端和5'末端的引物的反应溶液接触，其中所述引物包含：（i）提高引物的解链温度（Tm）的核苷酸类似物和（ii）防止引物二聚体形成的核苷酸类似物；以及c）扩增所述核酸模板。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.02.15 US 61/599,119;2012.04.13 US 13/446,4741.用于扩增核酸的方法，包括：a）提供核酸模板；b）使核酸模板与包含DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和具有3'末端和5'末端的引物的反应溶液接触，其中所述引物包含：（i）核苷酸类似物2-氨基-脱氧腺苷（2-氨基-dA），其中2-氨基-dA的并入提高引物的解链温度（Tm），和（ii）核苷酸类似物2-硫代-脱氧胸苷（2-硫代-dT），其中在所述引物中核苷酸类似物2-氨基-dA和核苷酸类似物2-硫代-dT的并入防止引物二聚体形成，其中所述引物是六聚体，其中所述六聚体具有如下通用结构：(+N)(+N)(atN)(atN)(atN)*N，其中(+N)是六聚体的5'末端核苷酸，*N是六聚体的3'末端核苷酸，以及其中“N”表示脱氧腺苷（dA）、脱氧胞苷（dC）、脱氧鸟苷（dG）或脱氧胸苷（dT），“+”表示在核苷酸碱基之前的LNA，(atN)表示2-氨基-dA、dC、dG和2-硫代-dT的随机混合物，“*”表示硫代磷酸酯键；以及c）扩增所述核酸模板。2.权利要求1的方法，其中扩增所述核酸模板在等温条件下实施。3.权利要求1的方法，其中扩增所述核酸模板在高严格条件下实施。4.权利要求1的方法，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：JR纳尔逊，GA格罗斯曼，RS杜蒂，SJ莎，RC赫勒，
申请(专利权)人：通用电气公司，
类型：发明
国别省市：美国;US