用于检测HLA‑B27基因的检测试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一组用于快速检测HLA‑B27基因的检测试剂盒，同时建立了一种比较高效、灵敏的HLA‑B27基因快速检测方法。其检测试剂盒，使用方便，操作简单，大大简化了操作过程，并减少了在操作过程的污染，检测效果好，具有高灵敏度、高特异性、高选择性的特点，并实现对HLA‑B27基因的分型检测。提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷，通过直接检测PCR过程中荧光信号Ct值获得检测结果，不需要PCR电泳检测等后处理，克服了常规PCR技术的易污染、假阳性率高的缺点，能有效避免非特异性扩增，并且适合大批量样本的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种用荧光定量PCR技术检测HLA-B27基因的检测试剂盒和方法。
技术介绍
人类白细胞抗原(HLA)别名主要组织相容性抗原(MHC)，位于第6号染色体短臂6p21.3区域，全长约3.6Mb。HLA基因是目前已知的人类最复杂基因系统，根据其在染色体上的排列可分为3类：Ⅰ类基因区包含HLA-A、HLA-B与HLA-C；Ⅱ类基因区包含HLA-DR、HLA-DP与HLA-DQ；Ⅲ类基因区位于上述两类基因区域之间，主要编码补体、热休克蛋白等产物。1973年Brewerton首次报道人类组织相容性抗原HLA-B27(humanleucocyteantigenB27,HLA-B27)与强直性脊柱炎(AS)高度相关。AS是一种以骶髂关节和脊柱慢性炎症为主的自身免疫性疾病。该疾病病因尚未明确，一般认为本病发生与遗传因素和感染有关。该疾病直接诊断证据为，X线下脊柱的特征性改变及骶髂关节炎，但在该疾病发生早期，这种影像学诊断特征往往不明显，容易发生误诊和漏诊。近来，通过全基因组关联分析，证实HLA-B27基因与AS发生高度相关。HLA-B27是目前发现的与AS关联性最强的基因，对AS易感性贡献率为16％。国内外学者大量的研究表明90％以上AS患者为HLA-B27阳性，而正常人群中只有5％～10％的个体为HLA-B27阳性。即便HLA-B27阳性是AS确诊的既非必要也非充分条件，但HLA-B27对AS的早期诊断和治疗具有重要价值。与HLAI类其他分子一样，HLA-B27具有较高的遗传多态性。这些多态性位点大多数分布在第2、3外显子区域，编码抗原结合槽的α1和α2结构域。截止2016年10月，已发现的HLA-B27亚型已达155个，命名为HLA-B*27:01～HLA-B*27:156，其中，HLA-B*27:22由于在以后的研究中，发现其序列错误，因此被取消了该命名。研究发现，不同种族、不同地区人群疾病相关HLA-B27亚型基因分布差异很大，HLA-B*27:05多见于高加索人，HLA-B*27:02多见于地中海人，HLA-B*27:04多见于中国人。在中国人群中，HLA-B*27:04、HLA-B*27:05与AS均有较强的关联性，但前者关联性强于后者。而另外的亚型如HLA-B*27:06和HLA-B*27:09则被认为是对AS发生有保护作用。目前，HLA-B27基因检测方法，主要有聚合酶链反应-直接测序(PCR-SBT)法、序列特异性引物-聚合酶链式反应(PCR-SSP)法、流式细胞仪(FCM)法等。PCR-SBT法，是基于测序分型的聚合酶链反应，可直接获得DNA序列，确定所有存在的多态性，为最直接、最直观的方法。但是，由于基因结构的特殊性和所设计PCR引物等因素，测序结果可能会出现套峰，不利于结果的判读。且测序对试剂和仪器有特殊要求，操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低，不适合临床疾病快速辅助诊断。PCR-SSP法，其原理是根据已知HLA-B27基因片段，设计特异性引物直接进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，尽管该方法对仪器要求不高、操作简单、结果直观，在基层医疗卫生单位易于推广，但该方法最大的弊端是步骤多、操作易污染，易出现假阳性，无法实现批量化和自动化。流式细胞仪法(FCM)具有快速、自动化程度高，适合大规模样本检测的优点，但该方法中依赖的荧光单克隆抗体特异性不高，易与多种其他HLA抗原，如HLA-B7、HLA-B22等发生干扰反应，影响结果准确性。此外，流式细胞仪法属于血清学水平检测，无法确定样本准确的基因型。且流式细胞仪器材昂贵，维护成本高，对操作人员技术要求较高，因此限制了它在基层医疗单位的推广与应用。
技术实现思路
为克服现有技术检测能力的不足，本专利技术的目的是提供一种用于检测HLA-B27基因的检测试剂盒。本专利技术的另一个目的是提供一种用于检测HLA-B27基因的检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种用于检测HLA-B27基因的检测试剂盒，该检测试剂盒包括用于HLA-B*27:04基因检测的引物对1及检测探针1，和用于HLA-B*27:05基因检测的引物对2及检测探针2；其中，所述引物对1的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，所述检测探针1的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述引物对2的核苷酸序列如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示，所述检测探针2的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。如上所述的检测试剂盒，优选地，所述检测试剂盒还包括内部质控，其包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示。如上所述的检测试剂盒，优选地，所述检测试剂盒还包括HLA-B*27:04阳性对照物、HLA-B*27:05阳性对照物，其中，所述HLA-B*27:04阳性对照物含有如SEQIDNo.10和SEQIDNo.12所示的核苷酸序列，所述HLA-B*27:05阳性对照物含有如SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示的核苷酸序列。如上所述的检测试剂盒，优选地，所述检测探针1和所述检测探针2的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团。如上所述的试剂盒，优选地，试剂盒还包括10×PCR缓冲液、热启动DNA聚合酶、dNTPs、矿物油、阴性对照物：ddH2O。如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。一种快速检测HLA-B27基因的方法，该方法包括以下步骤：(1)从样品中提取DNA；(2)对提取的所述DNA，同时进行HLA-B*27:04基因检测的反应体系1和HLA-B*27:05基因检测的反应体系2的实时荧光PCR扩增；其中，在所述反应体系1中检测引物对1的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，检测探针1的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；在所述反应体系2中检测引物对2的核苷酸序列如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示，检测探针2的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，所述检测探针1和所述检测探针2的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；(3)收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；(4)结果判定：待测样品的所述HLA-B*27:04基因检测的反应体系1或所述HLA-B*27:05基因检测的反应体系2任一体系的荧光扩增曲线呈现典型的“S”型曲线，且Ct值≤26，则该待检样本基因型为HLA-B27阳性，否则为HLA-B27阴性。如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，所述反应体系1和所述反应体系2中还包括有作为内部质控的质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示，该质控探针的5＇端连接有不同于所述检测探针1和检测探针2的荧光基团，3＇端连接有不同于所述检测探针1和检测探针2的淬灭基团。如上所述的方法，优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测HLA‑B27基因的检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括用于HLA‑B*27:04基因检测的引物对1及检测探针1，和用于HLA‑B*27:05基因检测的引物对2及检测探针2；其中，所述引物对1的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述检测探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述引物对2的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，所述检测探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测HLA-B27基因的检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括用于HLA-B*27:04基因检测的引物对1及检测探针1，和用于HLA-B*27:05基因检测的引物对2及检测探针2；其中，所述引物对1的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，所述检测探针1的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述引物对2的核苷酸序列如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示，所述检测探针2的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物和探针检测试剂盒还包括内部质控，其包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示。3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括HLA-B*27:04阳性对照物、HLA-B*27:05阳性对照物，其中，所述HLA-B*27:04阳性对照物含有如SEQIDNo.10和SEQIDNo.12所示的核苷酸序列，所述HLA-B*27:05阳性对照物含有如SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示的核苷酸序列。4.如权利要求1-3中任一所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测探针1和所述检测探针2的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括10×PCR缓冲液、热启动DNA聚合酶、dNTPs、矿物油、阴性对照物：ddH2O；所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。6.一种快速检测HLA-B27基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)从样品中提取DNA；(2)对提取的所述DNA，同时进行HLA-B*27:04基因检测的反应体系1和HLA-B*27:05基因检测的反应体系2的实时荧光PCR扩增；其中，在所述反应体系1中检测引物对1的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，检测探针1的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；在所述反应体系2中检测引物对2的核苷酸序列如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示，检测探针2的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，所述检测探针1和所述检测探针2的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；(3)收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对...

【专利技术属性】
技术研发人员：严睿韬，段卫涛，赵平锋，
申请(专利权)人：武汉海吉力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42