本发明专利技术提供一种检测CYP2C19基因分型的荧光PCR试剂盒，属于体外核酸检测领域，包括检测基因CYP2C19*2和CYP2C19*3型的PCR反应液、Taq酶、尿嘧啶DNA糖基化酶；检测CYP2C19*2和CYP2C19*3基因的PCR反应液当中均包含PCR扩增引物、MGB探针等；检测基因CYP2C19*2型和CYP2C19*3型的扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ?IDNO：3-4及SEQ?ID?NO：5-6所示。本发明专利技术提供的试剂盒灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间短，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取代传统蛋白检测或普通PCR检测CYP2C19基因的分型诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中检测常用药物代谢的细胞色素氧化酶P4502C19(CYP2C19)基因的两个位点的基因型，即CYP2C19*2 (681G/A)与 CYP2C19*3 (636G/A)的荧光 PCR 试剂盒。
技术介绍
细胞色素P450(CytochromeP450，CYP450)是由一组结构和功能相关的超家族基因(Superfamily gene)编码的同工酶，在人类身体中，其主要存在于肝细胞微粒中。在 CYP450超家族中，CYP2是最大的家族，有15个亚家族，它们代谢约20%目前临床使用的药物。其中CYP2C19(S-美芬妥英羟化酶)是CYP450的主要成分之一，CYP2C19基因cDNA全长1940，含有9个外显子，编码区为1473bp。其编码的蛋白S-美芬妥英羟化酶代谢一系列临床药物，如氯吡格雷、美芬妥英、奥美拉唑、普萘洛尔、地西泮、去甲地西泮、舍曲林等。研究表明很多药物代谢表型的差异源于CYP2C19基因突变，中国人常见的两种单核苷酸突变为CYP2C1肿2型和CYP2C19*3型，分别为CYP2C19基因的第5外显子G681A和第4外显子G636A的突变。其中CYP2C1肿2型G681A点突变产生了一个异常的拼接位点，使外显子5'端的前40bp核苷酸发生缺失，改变了随后mRNA的阅读框，从而使蛋白的合成过早终止，使其合成的S-美芬妥英羟化酶缺乏血红素结合位点，使其失去活性。CYP2C19*3型 G636A点突变使编码色氨酸密码子变为终止子，也导致蛋白合成提前终止，使合成的酶缺乏血红素及底物结合区而失去活性。这些点突变引起了 S-美芬妥英羟化酶的活性和下降，代谢底物的能力减弱，使血药浓度增高，从而引起与血药浓度相关的药品不良反应。根据CYP2C19基因型改变而引起酶代谢活性的改变，可将人群根据对药物代谢能力分为三大类药物强代谢型(EM，extensive metabolisers)CYP2C19野生型，CYP2C19杂合型代表的是中间代谢型(IM)，弱代谢型(PM)为突变型纯合子。CYP2C1肿2在中国人中发生率是30%，CYP2C19*3是5%，而这两种突变几乎涵盖了中国人所有的弱代谢型(PM)。CYP2C19基因型与肿瘤发病危险性CYP2C19基因的遗传多态性与多种肿瘤癌症的发生有关。研究结果表明，CYP2C19 可能参与食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鳞状细胞肺癌、肝癌等前致癌物的活化，即 CYP2C19基因的突变将增加患食管癌、胃癌、肺癌、急性白血病鳞状细胞肺癌、肝癌的危险性。因此，对人群中CYP2C19基因进行分型检测，能为临床上对某些肿瘤的易感性预测以及早期癌变预警提供重要的理论依据，有助于肿瘤癌症的前期预防。CYP2C19基因主要影响的几种药物代谢有氯吡格雷氯吡格雷为噻吩并吡啶衍生物，是一类新型的抗血小板药物，氯吡格雷本身无治疗效应，它由细胞色素P450氧化生成活性代谢产物(一种硫醇衍生物)而发挥作用。CYP2C19的变异是目前发现的氯吡格雷疗效个体差异的主要原因。CYP2C19基因的突变降低了氯吡格雷抗血小板聚集的疗效，并呈现出基因剂量效应。美芬妥英美芬妥英是临床常用广谱抗癫痫药，其血药浓度、疗效和不良反应存在显著个体差异，主要与药物代谢及反应的遗传多态性有密切关系。其中CYP2C19基因多态性可引起不同个体服用美芬妥英后出现特异性的药理及毒理作用，造成药物治疗效果的差已升。奥美拉唑奥美拉唑是目前应用最为广泛的质子泵抑制剂(PPI)之一，能抑制胃酸分泌，但长期大剂量使用将增加患者骨折的危险。在CYP2C19强代谢型人群中，奥美拉唑 80%都是由CYP2C19代谢。故此，CYP2C19基因突变型人群使用奥美拉唑的疗效显著低于 CYP2C19基因野生型人群。CYP2C19基因参与的药物代谢还包括普萘洛尔、地西泮、去甲地西泮、舍曲林等， 患者对这些药物的敏感性、耐药性以及不良反应状况都与患者本身CYP2C19基因多态性相关。因此根据检测CYP2C19基因型的多态性来选择用药或者选择最小有效剂量治疗方案有重要的临床意义。CYP2C19基因多态检测技术目前常用的检测CYP2C19基因点突变的方法有(I)PCR-RFLP基于突变的发生而形成的限制性内切酶酶切位点的消失或增加的原理。是目前最简单、最常见的一种检测点突变的技术，操作简单，特异性较高。但无法分辨杂合子，只能识别有限的多态性。(2) PCR-SSCP法，扩增的DNA片段在非变性凝胶电泳中，因电泳迁移率不同，因而可将突变基因和正常基因区分开来。具有简便快速的优点，适于大批量筛选，但检出率受DNA长度影响大。(3)DNA测序法是检测点突变的金标准，与上述方法相比，最大的优点就在于能够直接显示已知突变位点的位置和类型，此外还能发现新的突变位点。但是，这种方法操作步骤繁琐，试剂和仪器昂贵，影响结果的因素多，对操作人员水平和实验室条件要求高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高特异性、高灵敏度、高效率的MGB探针法定性检测 CYP2C19的荧光PCR试剂盒。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种检测CYP2C19基因分型的荧光PCR试剂盒，所述试剂盒包括检测基因 CYP2C1肿2型的PCR反应液、检测基因CYP2C19*3型的PCR反应液、Taq酶、尿嘧啶DNA糖基化酶；所述的检测CYP2C1肿2和CYP2C19*3基因的PCR反应液中均包含PCR Buffer、dNTP、 PCR扩增引物、MGB探针；其中检测基因CYP2C19M型的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 3-4所示，所述检测基因CYP2C19*3型的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 7-8所示。进一步地，所述检测基因CYP2C1肿2型的MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID NO 1~2 所示，检测基因CYP2C19*3型的MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID NO :5_6所示。进一步地，所述试剂盒还包括CYP2C1肿2型阳性对照品、CYP2C19*3型阳性对照品以及阴性对照品。进一步地，所述CYP2C1肿2型阳性对照品包含CYP2C1肿2型阳性对照品1_1、 CYP2C1肿2型阳性对照品1-2和CYP2C1肿2型阳性对照品1_3 ；所述CYP2C19*3型阳性对照品包含CYP2C19*3型阳性对照品2-1、CYP2C 19*3型阳性对照品2_2以及CYP2C19*3型阳性对照品2-3进一步地，所述的CYP2C1肿2型阳性对照品1_1插入有如SEQ IDNO 10所示的核苷酸序列的野生纯合子质粒；CYP2C1肿2型阳性对照品1-2为插入有如SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列的突变纯合子质粒；CYP2C1肿2型阳性对照品1-3为由所述突变纯合子质粒和所述野生纯合子质粒组成的杂合子质粒。进一步地，所述杂合子质粒中，述突变纯合子质粒和所述野生纯合子质粒的比例为 1 1。进一步地，所述的CYP2C19*3型阳性对照品2-1为插入有如SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列的野生纯合子质粒；CYP2C19*3型阳性对照品2-2为插入有如SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列的突变纯合子质粒本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄双，
申请(专利权)人：长沙三济生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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