用高同源性寡核苷酸抑制非特异性扩增制造技术

本发明专利技术包括用于降低非目标核酸序列的扩增的抑制寡核苷酸；设计和使用此类寡核苷酸的方法，以及试剂盒和反应混合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用高同源性寡核苷酸抑制非特异性扩增专利技术背景聚合酶链式反应(PCR)扩增核酸在生物医学研究、诊断和生物技术中有许多应用。PCR的独特特异性能够实现在压倒性数量的其它序列存在的情况下选择性扩增特定核酸序列。此外，PCR可以将目标序列与差异在于一个单一碱基对的另一个序列区分开。例如，等位基因特异性PCR(AS-PCR)能够检测DNA中的小改变，甚至在野生型、非突变型DNA存在的情况下的单一核苷酸突变(美国专利号6,627,402)。在等位基因特异性PCR测定中，至少一条引物是等位基因特异性的，即设计成优先匹配目标序列(该序列的特异性变体)，但含有与非目标序列(该序列的其它变体)的识别性错配。理想地，只有当等位基因特异性引物杂交至目标序列时才发生引物延伸。在成功的等位基因特异性PCR中，核酸的目标变体得到扩增，而其它非目标变体未进行扩增，至少不会扩增到可检测到的水平。不幸的是，在许多目标的情况下，这种理想是无法实现的。常见的是，在PCR的后面循环中，序列的非目标变体的扩增也变得可检测。该现象被称为“突破扩增”。即使AS-PCR引物与目标序列完美互补(或至少，共享更大程度的互补性)且与非目标序列错配(或者具有更多个错配)，非目标序列的扩增经常不能完全避免。突破扩增在其中样品含有少量目标序列和大量非目标序列的测定中特别受关注。例如，在靶向肿瘤中的体细胞突变的测定，来自患者样品的细胞中只有一部分是肿瘤细胞。肿瘤细胞的一部分可以含有指示对特定抗肿瘤药物的易感性的突变(参见例如，美国专利号7,294,468和7,960,118中描述的突变)。在此类样品中，少数目标(突变)序列与大量非目标(非突变)序列混合。非突变序列的突破扩增可以产生假阳性结果，假性地指示突变的存在且误导患者的治疗。如果测定的特异性受突破扩增限制，则测定的临床实用性也是如此。已经提出了防止或降低非特异性扩增的各种方法(例如，影响扩增引物的特异性的化学修饰，参见美国专利号6,011,611；使用阻断剂寡核苷酸，参见美国申请公开号200953720)。然而，这些方法在完全消除突破扩增中并不总是成功的。因此，存在对于防止或尽量减少核酸扩增反应中的突破扩增的替代方法的需求。专利技术概述在一个实施方案中，本专利技术是用于在核酸扩增反应中使用的抑制寡核苷酸，其具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列。在另一个实施方案中，本专利技术是设计用于在核酸扩增反应中使用的抑制寡核苷酸的方法，其包括使用序列比对算法来选择具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的寡核苷酸。在又另一个实施方案中，本专利技术是降低核酸扩增反应中非目标核酸模板的扩增的方法，其包括在具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸存在的情况下进行扩增反应。在又另一个实施方案中，本专利技术是用于在降低扩增非目标序列的情况下进行扩增反应的试剂盒，其包含具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸。在又另一个实施方案中，本专利技术是用于在降低扩增非目标序列的情况下进行扩增反应的反应混合物，其包含具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸。在又另一个实施方案中，本专利技术是具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸在核酸扩增反应中以降低非特异性扩增的用途。附图概述图1显示通过等位基因特异性PCR扩增人NRAS基因的外显子2(包括密码子12),其中通过也用作引物之一的抑制寡核苷酸抑制突破。图1A显示未抑制的突破扩增(虚线)，且图1B显示了非目标序列扩增的抑制。图2显示通过等位基因特异性PCR扩增人NRAS基因的外显子3(包括密码子61)，其中通过不与目标序列互补的抑制寡核苷酸抑制突破。图2A显示在没有抑制寡核苷酸的情况下没有抑制突破扩增，图2B显示当抑制寡核苷酸以低浓度存在时没有抑制，并且图2C显示当抑制寡核苷酸以较高相对浓度存在时的抑制。图3显示通过等位基因特异性PCR扩增人PI3KCA基因，其中通过不与目标序列互补的抑制寡核苷酸抑制突破。图3A显示在抑制寡核苷酸不存在的情况下的突破扩增，且图3B显示在抑制寡核苷酸存在的情况下突破扩增的抑制。图4显示通过等位基因特异性PCR扩增人BRAF基因(包括密码子469和600)，其中通过不与目标序列互补的抑制寡核苷酸抑制突破。图4A显示在密码子469反应中，在抑制寡核苷酸不存在的情况下的突破扩增，且图4B显示在密码子469反应中，在抑制寡核苷酸存在的情况下突破扩增的抑制。图4C显示在密码子600反应中，在抑制寡核苷酸不存在的情况下的突破扩增，且图4D显示在密码子469反应中，在抑制寡核苷酸存在的情况下突破扩增的抑制。图5显示通过等位基因特异性PCR扩增人NRAS基因的外显子2和3,其中M13目标的同时线性扩增对于外显子3(密码子61)抑制突破，但对于外显子2(密码子12)没有抑制突破。图6显示通过等位基因特异性PCR扩增人NRAS基因的外显子2，其中与目标序列具有不同同源性的抑制寡核苷酸抑制突破。图6A显示具有低同源性程度的抑制寡核苷酸没有抑制突破扩增；图6B显示具有中等同源性程度的寡核苷酸的部分抑制；并且图2C显示具有高同源性程度的寡核苷酸的完全抑制。图7显示对于用于设计抑制寡核苷酸的人NRAS基因的外显子2的目标区域的BLAST的BLAST®搜索的结果。图8显示从人NRAS基因的外显子2中目标区域选择抑制寡核苷酸的一个实例。专利技术详述为了便于理解本公开内容，提供了本文使用术语的以下定义。术语“等位基因特异性引物”或“AS引物”指以下引物：所述引物可以与多于一个目标序列的变体杂交，但能够在目标序列的变体中区分，从而使得只有在所述引物杂交到一个特定变体时，核酸聚合酶在合适条件下对所述引物的有效延伸才会发生。对于目标序列的其它变体，延伸效率更低或是无效的。术语“扩增子”是指作为聚合酶链式反应的产物形成的核酸。术语“通用引物”是指包括等位基因特异性引物的引物对中的第二引物。通用引物不是等位基因特异性的，即无法在等位基因特异性引物可以区分的目标序列的变体之间进行区分。术语“互补的”或“互补性”参考Watson-Crick碱基配对法则涉及的多核苷酸的反向平行链使用。互补核酸链在标准杂交条件下能够形成双链体。术语“完美互补的”或“100％互补的”指在反向平行链之间所有碱基都具有Watson-Crick配对的互补序列，即，在多核苷酸双链体中任何两个碱基之间不存在错配。术语“部分互补的”或“不完全互补的”是指在反向平行多核苷酸链之间少于100％完美的碱基的任何比对(例如，在多核苷酸双链体中存在至少一个错配或未配对的碱基)。较小核酸链(例如，寡核苷酸)可以与更大核酸(例如基因或基因组)中的区域(位点)是互补的。在标准杂交条件下，双链体会在反向平行链之间、甚至在缺少完美互补性的反向平行链之间形成。然而，部分互补链之间的双链体通常比完美互补链之间的双链体更不稳定。核酸扩增分析背景中的“生长曲本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在核酸扩增反应中使用的抑制寡核苷酸，其具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.02 US 61/566,5181.设计用于在核酸扩增反应中使用以减少非特异性扩增的抑制寡核苷酸的方法，所述方法包括：(a)鉴定目标生物体的基因组中一个或多个目标区域；(b)对于每个目标区域，使用所述目标区域作为查询进行所述目标基因组序列的搜索来鉴定所述目标区域和所述目标基因组之间的同源性区域；(c)选择在所述目标基因组中具有最多同源性区域的目标区域的区段；(d)在步骤(c)中选择的区段中设计一个或多个寡核苷酸；(e)用步骤(d)中设计的寡核苷酸进行目标基因组的搜索，以鉴定与所述目标基因组具有最高同源性区域数目的寡核苷酸，其中所述同源性区域为至少15个碱基对长，所述寡核苷酸与目标基因组之间的同源性区域具有至少75％同一性，且所述同源性区域跨越所述寡核苷酸的3’-末端，同时在所述寡核苷酸3'-末端的4个核苷酸内存在不超过2个错配，且所述寡核苷酸与要在扩增反应中扩增的目标序列不具有互补性区域；(f)选择步骤(e)中鉴定的寡核苷酸作为抑制寡核苷酸。2.权利要求1的方法，在步骤(e)和(f)之间进一步包括用步骤(d)中设计的寡核苷酸进行所述目标基因组的搜索，以鉴定和排除具有位于所述目标基因组的相对链上至少两个同源性区域的寡核苷酸，所述同源性区域在所述寡核苷酸和所述目标基因组序列之间具有至少75％同一性，其中所述同源性区域被少于1000个碱基对隔开。3.降低目标生物体基因组中目标序列的核酸扩增反应中非目标核酸模板的扩增的方法，其包括在抑制寡核苷酸存在的情况下使用包含至少一条对目标序列的变体特异的等位基因特异性引物的引物组进行扩增反应，所述抑制寡核苷酸可通过线性引物延伸进行延伸，与目标序列不具有互补性区域；且具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列，...

【专利技术属性】
技术研发人员：X陈，S程，TW迈尔斯，N帕滕，N舍恩布伦纳，SJC张，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH