用于降低非特异性扩增的方法和试剂技术

本发明专利技术提供了用于核酸扩增的方法和试剂。与使用未经修饰的寡核苷酸进行的扩增相比较，使用含有N2-苄基-dG核苷酸的探针寡核苷酸进行的扩增和检测可以导致更少的涉及探针的非特异性扩增，可能这是由于在模板中大量N2-苄基-dG小沟结合剂的存在防止通过DNA聚合酶的互补链的延伸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于降低非特异性扩增的方法和试剂专利
本专利技术涉及分子生物学和核酸化学领域。更具体而言，它涉及用于改进核酸扩增反应的可靠性的方法和试剂。专利技术背景 聚合酶链反应(PCR)的专利技术使得核酸序列的体外扩增成为可能。PCR在美国专利号 4，683，195 ;4，683，202 ；和 4，965，188 ；Saiki 等人，1985，Science 230:1350-1354 ；Mullis 等人，1986, Cold Springs Harbor Symp.Quant.Biol.51:263-273 ;以及 Mullis 和Faloona, 1987，Methods Enzymo1.155:335-350中描述。PCR的开发和应用在文献中广泛描述。例如，一系列 PCR相关主题在 PCR Technology - principles and applications for DNAamplification, 1989, (H.A.Erlich编辑)Stockton Press, New York ；PCR Protocols: A guideto methods and applications, 1990, (M.A.1nnis 等人编辑)Academic Press, San Diego ；和 PCR Strategies, 1995, (M.A.1nnis 等人编辑)Academic Press, San Diego 中讨论。商业供应商例如Applied Biosystems (Foster City, CA)销售PCR试剂和公开PCR方案。 自从核酸扩增的原始出版物以后，多种基于引物的核酸扩增方法已得到描述，包括但不限于链置换测定(Walker 等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:392-396，Walker 等人，1992，Nucleic Acids Res.20:1691-1696 和美国专利号 5，455，166)和基于转录的扩增系统，包括美国专利号5，437，990 ;5，409，818 ;和5，399,491中所述的方法；转录扩增系统(TAS ) (Kwoh 等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86:1173-1177);和自主序列复制(3SR) (Guatelli 等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 87:1874-1878和 WO 92/08800)。扩增系统的调查在 Abramson 和 Myers, 1993, Current Opinion inBiotechnology 4:41-47 中提供。基于引物的扩增反应的特异性在很大程度上依赖引物杂交和延伸的特异性。在典型扩增中使用的高温下，引物仅与预期靶序列杂交。然而，扩增反应混合物通常在室温下组合，远低于确保引物杂交特异性所需的温度。在此类较不严格的条件下，引物可以与其他仅部分互补的核酸序列或与其他引物非特异性结合，并且起始不希望的延伸产物的合成，其可以沿靶序列扩增。非特异性引物延伸产物的扩增可以与所需靶序列的扩增竞争，并且可以显著降低所需序列的扩增效率。一种经常观察到的类型的非特异性扩增产物是被称为“引物二聚体”的模板不依赖性扩增反应假象(artifact)。引物二聚体是这样的双链片段，其长度通常接近于两条引物长度总和，并且看起来当一条引物在另一条引物上延伸时发生。所得到的延伸产物形成不希望的模板，因为其短长度，所以所述不希望的模板被有效扩增。非特异性扩增可以通过在反应开始前降低引物延伸产物形成而降低。在被称为“热启动”方案的一种方法中，一种或多种关键试剂从反应混合物中扣留，直至温度足够升高以提供所需杂交特异性时。其中反应管在初始高温温育步骤后打开并加入缺少的试剂的手动热启动方法是费力的，并且增加反应混合物污染的风险。或者，热敏感材料例如蜡可以用于分开或隔离反应组分，如美国专利号5，411，876和Chou等人，1992，Nucl.Acids Res.20 (7):1717-1723中所述。在这些方法中，高温反应前温育熔化热敏感材料，由此允许试剂混合。在反应开始前降低引物延伸产物形成的另一种方法依赖DNA聚合酶的热可逆失活。美国专利号5，773，258和5，677，152描述了通过改性剂基团(modifier group)的共价连接可逆修饰的DNA聚合酶。失活的DNA聚合酶在高温下温育导致改性剂(modifier)-酶键的断裂，由此使酶再活化。DNA聚合酶通过DNA聚合酶特异性抗体的非共价可逆抑制在美国专利号5，338，671 中描述。非特异性扩增还可以使 用美国专利号5，418，149中描述的方法，通过在反应开始前酶促降解形成的延伸产物而降低。新近合成的延伸产物的降解通过下述实现:将dUTP和UNG掺入反应混合物内，并且在进行扩增反应前，使反应混合物在45-60°C下温育。引物延伸导致形成含尿嘧啶DNA，其在扩增前条件下由UNG降解。该方法的缺点是延伸产物的降解与延伸产物的形成竞争，并且非特异性引物延伸产物的消除可能是较不完全的。该方法的优点是作为来自先前反应的污染引入反应混合物内的含尿嘧啶DNA也被降解，并且因此该方法还降低PCR由来自先前反应的扩增核酸污染的问题。在反应开始前降低引物延伸产物形成的另一种方法依赖于使用在3’端处或附近通过将基团加入环外胺(exocyclic amine)而修饰的引物,如美国专利号6，001，611中所述。在本领域技术内的分子生物学和核酸化学的常规技术在文献中充分说明。参见例如，Sambrook 等人，1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York ；01igonucleotide Synthesis (M.J.Gait,编辑，1984) ；Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames 和 S.J.Higgins.编辑，1984) ；PCRTechnology - principles and applications for DNA amplification, 1989, (H.A.Erlich编辑)Stockton Press, New York ；PCR Protocols: A guide to methods and applications,1990, (M.A.1nnis 等人编辑)Academic Press, San Diego ;和 PCR Strategies, 1995, (M.A.1nnis 等人编辑)Academic Press, San Diego。专利技术概述 本专利技术基于令人惊讶的发现:在某些扩增反应中，特别是在含有多条引物和探针用于扩增和检测多种靶核酸的反应(例如多重PCR反应)中，一条或多条探针可能充当可能导致非特异性扩增的模板，所述非特异性扩增依次又产生假阳性的信号。为了降低PCR中基于探针的非特异性扩增，可以使用干扰DNA聚合酶活性但仍能够与互补核苷酸碱基配对的小沟本文档来自技高网...

【技术保护点】
在采用以模板依赖性方式的引物延伸的测定中，防止与模板核苷酸序列杂交的引物寡核苷酸通过DNA聚合酶延伸的方法，其包括将小沟结合剂掺入所述模板核苷酸序列上，并且其中所述引物寡核苷酸不能被延伸超出N2‑苄基‑dG核苷酸位置多于2个核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.22 US 61/5793171.在采用以模板依赖性方式的引物延伸的测定中，防止与模板核苷酸序列杂交的引物寡核苷酸通过DNA聚合酶延伸的方法，其包括将小沟结合剂掺入所述模板核苷酸序列上，并且其中所述引物寡核苷酸不能被延伸超出N2-苄基-dG核苷酸位置多于2个核苷酸。2.权利要求1的方法，其中所述小沟结合剂是经修饰的核苷酸。3.权利要求3的方法，其中所述经修饰的核苷酸是N2-苄基-脱氧鸟苷(N2-苄基-dG)。4.权利要求1的方法，其中所述测定选自PCR扩增、DNA测序和基因分型。5.权利要求4的方法，其中所述测定是PCR扩增。6.降低或防止在扩增反应过程中核酸的非特异性扩增的方法，其包括提供能够扩增靶核酸序列的至少一对引物寡核苷酸；和提供掺入小沟结合剂的探针寡核苷酸，当所述引物寡核苷酸与所述探针寡核苷酸杂交时，所述小沟结合剂阻断所述引物寡核苷酸通过DNA聚合酶延伸超出经修饰的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：V博德普迪，NJ舍恩布伦纳，S威尔，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH