用于治疗肿瘤的PD-1封闭CIK的制备方法技术

用于治疗肿瘤的PD‑1封闭CIK的制备方法,属于医疗领域，抗人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶；激活步骤，利用所述CD3单克隆抗体、IFNγ以及IL‑2激活培养淋巴细胞；清洗步骤，清洗三次激活培养后的所述淋巴细胞；封闭步骤，用生理盐水悬浮所述清洗后的淋巴细胞，得到悬浮细胞溶液，向所述悬浮细胞溶液中加入PD‑1单克隆抗体，混悬孵育；向所述PD‑1单克隆抗体孵育后的细胞悬液补加生理盐水制得回输细胞悬液。本发明专利技术方法制备PD‑1封闭的CIK具有PD‑1单克隆抗体的用量少、封闭PD‑1分子的效果好、肿瘤杀伤活性高等特点。同时具备操作简单、制备成本低和便于临床应用的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医疗领域，特别是用于治疗肿瘤的PD-1封闭CIK的制备方法。
技术介绍
程序性死亡受体1(PD-1)是一种表达于T细胞表面的蛋白质分子，当PD-1与其配体PD-L1或PD-L2结合时可抑制下游NF-κB基因的转录，抑制干扰素-δ的分泌，从而抑制T细胞杀伤活性。PD-L1或PD-L2表达于多种肿瘤细胞，如肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肝细胞癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、肾细胞癌以及尿路上皮癌等肿瘤组织高表达PD-L1。T细胞表面的PD-1与表达于肿瘤细胞上的PD-L1结合所引起的T细胞细胞毒活性抑制是肿瘤细胞逃避免疫监视和杀伤的重要机制之一。采用PD-1抗体或PD-L1抗体阻断PD-1与PD-L1、PD-L2的结合，可使T细胞的杀瘤活性不受抑制，从而提高T细胞杀瘤的效果。研究证实采用PD-1单克隆抗体静脉输注治疗恶性黑色素瘤、肺鳞癌、结肠癌及肾癌等肿瘤收到良好的治疗效果。然而，静脉输注进入体内的PD-1抗体将被人体4000ml-5000ml的血液稀释，因此为了维持有效药物浓度需要输注PD-1抗体的量较大。同时血液成分、淋巴组织微环境结构与成分复杂，不仅会造成PD-1抗体的损耗也会影响到PD-1抗体与T细胞表面的PD-1的结合。CIK是多种细胞因子诱导的杀伤细胞，现行CIK激活培养方法易于获得大量的效应细胞。然而这些效应细胞有较高的PD-1表达率，这在一定程度上影响了CIK的肿瘤杀伤效果和临床疗效。正在申请阶段的专利技术CN201511018960.1、CN201610278810.2、CN201410573897.7及CN201410573311.7，在自体外周血淋巴细胞体外培养过程中加入PD-1抗体，收集细胞时洗弃未结合的PD-1抗体。治疗用淋巴细胞培养过程中培基量通常在1500ml左右，培基的总体积较大，PD-1抗体的用量依然较大，同时培养后未结合的PD-1抗体在洗细胞时随培基弃掉，造成一定的浪费。另外，在培养过程中细胞的分泌物与代谢产物，在一定程度上可影响的PD-1抗体与PD-1的结合，从而影响PD-1的封闭效果。治疗用PD-1抗体的价格昂贵，静脉输注或CIK培养过程中加入PD-1抗体，PD-1抗体的用量大、成本高及PD-1封闭效果易受影响等弊端，极大地影响了PD-1抗体的临床应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足，旨在提供一种细胞增殖倍数大、杀伤活性高且制备成本低的肿瘤杀伤效应细胞的制备方法。本专利技术的技术方案为：用于治疗肿瘤的PD-1封闭CIK的制备方法，包含如下步骤：抗人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶；激活步骤，利用所述CD3单克隆抗体、IFNγ以及IL-2激活培养淋巴细胞；清洗步骤，清洗三次激活培养后的所述淋巴细胞；封闭步骤，用20-50ml生理盐水悬浮所述清洗后的淋巴细胞，得到悬浮细胞溶液，向所述悬浮细胞溶液中加入PD-1单克隆抗体，18-25℃混悬孵育30分钟得到细胞悬液。优选地，所述的用于治疗肿瘤的PD-1封闭CIK的制备方法进一步包含步骤：过滤步骤，向所述细胞悬液中加入细胞分散剂200目滤网过滤后补加生理盐水至300ml得到回输液。优选地，所述抗人CD3单克隆抗体包被细胞瓶包含如下步骤：采用0.01MPH9.6的PBS溶液稀释甲级纯化抗人CD3单克隆抗体到浓度50-70ng/ml；将稀释后的所述甲级纯化抗人CD3单克隆抗体加入到培养瓶中，4℃放置24小时以上。优选地，所述激活步骤包含如下步骤：将肝素抗凝血注入离心管A中,4℃温度下以3000rpm离心5min；取上层血浆移入离心管B，56℃水浴30min,在4℃温度下以3000rpm离心15min，收集上清，4℃保存备用；下层血细胞留于离心管A中备用；生理盐水悬浮所述离心管A中的所述血细胞，将制得的血细胞悬液缓慢加入到装有4ml的密度为1.077±0.001的Ficoll-Hypaque的离心管中，在4℃温度下以3000rpm离心20min；收集单个核细胞层细胞并采用离心法清洗所述细胞三次；加入无血清培基重悬，制得无血清培基悬浮细胞；将所述的无血清培基悬浮细胞中加入到含有所述抗人CD3单克隆抗体包被的培养瓶中，加入灭活血浆并补加入无血清培基，37℃、5％CO2条件下培养24小时；向培养瓶中加入IFNγ，37℃、5％CO2条件下培养4-6天；取培养后的细胞移入细胞培养袋中，加入无血清培基、灭活血浆和IL-2，37℃、5％CO2条件下培养4-5天；补加无血清培基和IL-2，37℃、5％CO2条件下培养4-5天。优选地，在所述清洗步骤前还包含：检验步骤，进行细胞培养后检测细胞数量，并利用PCR技术检测培养上清液中的支原体。本专利技术的有益效果为：PD-1单克隆抗体的用量少，PD-1分子封闭效果好，PD-1封闭的CIK的肿瘤杀伤活性高。同时具有操作简单、制备成本低和便于临床应用的特点。附图说明图1为CIK细胞的PD-1分子的表达率；图2为PD-1单克隆抗体封闭CIK细胞PD-1分子的检出率；图3为CIK与PD-1封闭CIK的肿瘤细胞杀伤率比较。具体实施方式下面结合附图、通过具体实施例对本专利技术作进一步详述。以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。实验器材低温常速离心机(美国，Beckman)、CO2细胞培养箱(日本，Sanyo)、移液器(美国,Thermo)、刻度吸管(美国，Kimble)、75cm2培养瓶(美国，Corning)、15ml离心管(美国，Corning)、50ml离心管(美国，Corning)、细胞刮刀(美国，Corning)、细胞滤器(美国，Corning)、倒置显微镜(日本，Nikon)、冻存管(美国，Corning)，96孔细胞培养板(美国，Corning)、酶标仪(美国，BioTek)、流式细胞仪(美国，BD)。实验试剂Ficoll-Hypaque细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司))、氯化钠注射液(石家庄四药公司)、肝素钠(上海第一生化药业有限公司)、IFN-γ(北京四环生物制药有限公司)、IL-2(北京双鹭药业股份有限公司)、甲级纯化抗人CD3单克隆抗体(美国，eBioscience)、无血清培基(美国，Thermo)、人血清白蛋白(山西康宝生物制品股份有限公司)、Pembrolizumab(美国，MSD)、FITC标记鼠抗人CD3单克隆抗体(美国，BD)、PE标记兔抗人PD-1单克隆抗体(美国，eBioscience)、Hank’s液(配制方法：1.甲液：NaCl160g、KCl8g、MgSO4·7H2O2g、MgCl2·6H2O2g加入到800ml三蒸水，溶解。CaCl22.8g溶于100ml三蒸水，溶解后加入到上述800ml溶液中，补足三蒸水至1000ml。2.乙液：Na2HPO4·12H2O3.04g、KH2PO41.2g、葡萄糖20g加入800ml双蒸水，溶解。加入0.4％酚红溶液100ml，上述二液混合，加三蒸水至1000ml。使用时按甲液1份、乙液1份、三蒸水18份滤过，8磅20min分钟灭菌，4℃保存)、NaCl(国药泸试)、KCl(国药泸试)、MgSO4·7H2O(天津致远化学有限公司)、MgCl2·6H2O(天津致远本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于治疗肿瘤的PD‑1封闭CIK的制备方法，其特征在于包含如下步骤：包被步骤，抗人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶；激活步骤，利用所述CD3单克隆抗体、IFNγ以及IL‑2激活培养淋巴细胞；清洗步骤，清洗三次激活培养后的所述淋巴细胞；封闭步骤，用20‑50ml生理盐水悬浮所述清洗后的淋巴细胞，得到悬浮细胞溶液，向所述悬浮细胞溶液中加入PD‑1单克隆抗体，18‑25℃混悬孵育30分钟得到细胞悬液。

【技术特征摘要】
1.用于治疗肿瘤的PD-1封闭CIK的制备方法，其特征在于包含如下步骤：包被步骤，抗人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶；激活步骤，利用所述CD3单克隆抗体、IFNγ以及IL-2激活培养淋巴细胞；清洗步骤，清洗三次激活培养后的所述淋巴细胞；封闭步骤，用20-50ml生理盐水悬浮所述清洗后的淋巴细胞，得到悬浮细胞溶液，向所述悬浮细胞溶液中加入PD-1单克隆抗体，18-25℃混悬孵育30分钟得到细胞悬液。2.根据权利要求1所述的用于治疗肿瘤的PD-1封闭CIK的制备方法,其特征在于进一步包含步骤：过滤步骤，向所述细胞悬液中加入细胞分散剂200目滤网过滤后补加生理盐水至300ml得到回输液。3.根据权利要求1所述的用于治疗肿瘤的PD-1封闭CIK的制备方法,其特征在于，所述抗人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶包含如下步骤：采用0.01MPH9.6的PBS溶液稀释甲级纯化抗人CD3单克隆抗体到浓度50-70ng/ml；将稀释后的所述甲级纯化抗人CD3单克隆抗体加入到培养瓶中，4℃放置24小时以上。4.根据权利要求1所述的用于治疗肿瘤的PD-1封闭CIK的制备方法,其特征在于所述激活步骤包含如下步骤：将肝素抗凝血注入离心管A中,4...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁小林，杨真，袁儒非，孙秀艳，李纯，崔益芬，关庆琳，张青，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21